張 琪，朱 丹，牛廣財(cái),3,*，顏飛翔，魏文毅,3，朱 磊,3，王思溥

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）又名醋柳、酸刺，是胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，其果實(shí)為球形或近卵形小漿果，為橘黃色或橘紅色[1]，素“長(zhǎng)壽果”、“神果”和“圣果”之美譽(yù)，也是珍貴的藥食同源植物，收錄于《中國(guó)藥典》[2]。沙棘果實(shí)含有黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、多糖類(lèi)、維生素類(lèi)、不飽和脂肪酸、氨基酸、5-羥色胺等多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[3-5]，廣泛應(yīng)用于食品和保健品等領(lǐng)域，具有增強(qiáng)人體免疫力，抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理功能[6-8]。

高通量測(cè)序技術(shù)代替了傳統(tǒng)上微生物分析所采用的分離培養(yǎng)方法，該過(guò)程無(wú)需分離純化，就可一次性對(duì)樣品中的幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，可快速確定其中微生物的種類(lèi)和豐度[9]，具有測(cè)定速度快、結(jié)果精準(zhǔn)、利用微量樣品即可實(shí)現(xiàn)所有微生物的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，能夠更精確分析樣品中微生物群落多樣性和相應(yīng)的功能分析。該技術(shù)應(yīng)用范圍較廣泛，主要在人類(lèi)疾病與健康、海洋、植物多樣性、發(fā)酵食品、環(huán)境檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[10-15]。近年來(lái)，利用該技術(shù)研究微生物分子生態(tài)學(xué)已成首選方法，可以全面揭示樣本微生物種群組成及其多樣性[16]。吳進(jìn)菊等[17]對(duì)襄陽(yáng)大頭菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes），相對(duì)豐度分別為26.14%～78.12%和8.33%～70.12%，而在屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為鹽厭氧菌（Halanaerobium）、弧菌（Vibrio）、鹽單胞菌（Halomonas）、乳桿菌（Lactobacillus）和色鹽桿菌（Chromohalobacter）。高慶超等[18]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究黑果枸杞酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化，共檢測(cè)出26種已知的細(xì)菌門(mén)，48種已知的細(xì)菌屬，其中0 d優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria，占比約為99%，主要菌屬為泛菌（Pantoea）71.35%、假單胞菌（Pseudomonas）14%、歐文氏菌（Erwinia）6.61%；發(fā)酵第10、20、30、40、50、60天Firmicutes為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比為96.9%～99.1%。

食用植物酵素以植物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分（多糖類(lèi)、寡糖類(lèi)、蛋白質(zhì)及多肽、氨基酸類(lèi)、維生素類(lèi)等）可食用的酵素產(chǎn)品[19]。目前，國(guó)內(nèi)酵素產(chǎn)業(yè)多以天然發(fā)酵為主。但該種方式受環(huán)境條件影響較大，發(fā)酵過(guò)程中微生物的菌群比較復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量較難控制。因此，研究自然發(fā)酵食用酵素中微生物菌群的變化規(guī)律，是篩選酵素優(yōu)良與優(yōu)勢(shì)菌種的基礎(chǔ)。截至目前，鮮見(jiàn)有關(guān)沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性方面研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同發(fā)酵階段的沙棘酵素中細(xì)菌種群組成及多樣性進(jìn)行研究，以期開(kāi)發(fā)和應(yīng)用酵素優(yōu)良菌種，為沙棘酵素的可控發(fā)酵、安全高效生產(chǎn)和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍大果沙棘，黑龍江省孫吳縣寶江大果沙棘展銷(xiāo)中心提供。

Pectinex BEXXL果膠酶（酶活力10 000 U/mL）諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；FastDNA?Spin Kit for Soil型號(hào)DNA抽提試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuPolymerase北京TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit美國(guó)Axygen公司；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒 美國(guó)Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；Quantus? Fluorometer微型熒光計(jì) 美國(guó)Promega公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 采集流程

沙棘酵素自然發(fā)酵法制備：首先將-20 ℃冷凍的大果沙棘在常溫下解凍，用打漿機(jī)進(jìn)行打漿，用Pectinex BEXXL果膠酶進(jìn)行酶解，酶解條件為2.0 mL/kg的添加量，于45 ℃酶解4 h[20]；用白砂糖調(diào)整糖度至21 °Brix[21]后，在22 ℃恒溫條件下進(jìn)行自然發(fā)酵。

沙棘酵素樣品的采集：在發(fā)酵72～1 584 h期間，根據(jù)其還原糖、體積分?jǐn)?shù)和pH值等指標(biāo)進(jìn)行分階段取樣，發(fā)酵第72小時(shí)第1次取樣，命名為發(fā)酵前期（F22_Q），發(fā)酵第624小時(shí)第2次取樣，命名為發(fā)酵中期（F22_Z），發(fā)酵1 584小時(shí)第3次取樣，命名為發(fā)酵后期（F22_H）。取樣方法是將發(fā)酵液在錐形瓶中混合均勻，然后取15 mL于離心管中，置-80 ℃冰箱中冷凍，用于微生物測(cè)序。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[22]；乙醇：參照GB 5009.225ü2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》酒精計(jì)法測(cè)定[23]；pH值：采用酸度計(jì)法測(cè)定。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳

檢測(cè)前將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取3 μL上樣檢測(cè)。檢測(cè)條件為2%瓊脂糖膠、電壓5 V/cm、時(shí)間20 min。

1.3.4 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度；使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃進(jìn)行保存。PCR體系為：5hFastPfuBuffer緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfuPolymerase DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 Illumina MiSeq測(cè)序

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，該部分送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接；然后使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)?xì)菌比對(duì)采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU128）；根據(jù)OTU聚類(lèi)分析結(jié)果，采用Mothur計(jì)算分析樣品的α多樣性，包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和覆蓋率；利用R語(yǔ)言進(jìn)行菌群多樣性分析，并繪制柱狀圖、Venn圖和熱圖[24]，結(jié)合基于Bary-Curtis距離算法的主成分分析（principal component analysis，PCA）圖分析微生物結(jié)構(gòu)組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中主要理化指標(biāo)的變化

由圖1可知，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由初始值21.1%呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，至發(fā)酵后期還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為10.3%；乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化正好與之相反，在發(fā)酵前期增長(zhǎng)較快，在624 h之后保持穩(wěn)定，在1 584 h達(dá)到4.24%；還原糖含量下降速度比較均勻，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液中的微生物能夠充分利用糖類(lèi)物質(zhì)，消耗糖類(lèi)而產(chǎn)生乙醇或者其他物質(zhì)；pH值在整個(gè)發(fā)酵中呈先上升后下降的趨勢(shì)，這可能與一些微生物將有機(jī)酸作為替代碳源被部分消耗有關(guān)[25]。

圖1 沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中的還原糖含量、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值的變化Fig.1 Changes in the contents of reducing sugar and alcohol and pH during the fermentation of sea buckthorn jiaosu

2.2 瓊脂凝膠電泳鑒定

沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中不同發(fā)酵階段的發(fā)酵液中細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，沙棘酵素自然發(fā)酵共分為3個(gè)階段（F22_Q、F22_Z、F22_H）9個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在500 bp左右，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度接近，特異性和亮度均較好，可滿足下一步的測(cè)序要求。

圖2 沙棘酵素發(fā)酵液細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoresis images of PCR amplified products of bacterial 16S rRNA gene from sea buckthorn jiaosu

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.3.1 測(cè)序樣本數(shù)據(jù)分析

沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中的3個(gè)不同發(fā)酵階段樣品，經(jīng)測(cè)序后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)序列擴(kuò)增區(qū)域338F_806R，可得到原始序列信息，經(jīng)優(yōu)化后得到的序列信息如表1所示。通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)整理原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)優(yōu)化，沙棘酵素自然發(fā)酵樣品優(yōu)化序列范圍為38 917～70 982 條，平均長(zhǎng)度范圍為403.10～418.10 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度接近。由于平行樣本之間存在誤差，但是誤差較小，在允許誤差范圍內(nèi)，所以數(shù)據(jù)樣本具有有效性，質(zhì)控合格。

表1 樣本測(cè)序結(jié)果Table 1 Results of bacterial 16S rRNA gene sequencing

2.3.2 測(cè)序樣本結(jié)果分析

稀釋曲線主要利用各沙棘酵素樣品在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物α多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣品在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。圖3、4為沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中不同發(fā)酵階段細(xì)菌的稀釋曲線圖。如圖3所示，在測(cè)序深度小于20 000時(shí)，隨著序列數(shù)不斷增加，Sobs指數(shù)顯著增加，但是當(dāng)序列數(shù)介于20 000～40 000時(shí)，Sobs指數(shù)緩慢增加，最終曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。如圖4所示，在測(cè)序數(shù)據(jù)量0～40 000范圍內(nèi)，Shannon指數(shù)曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

圖3 Sobs指數(shù)稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of Sobs index

圖4 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curves of Shannon index

2.3.3α多樣性分析

為保證測(cè)序序列的均一性，按照最小樣本進(jìn)行抽平后，根據(jù)分類(lèi)單元個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)，得到1個(gè)域，1個(gè)界，25個(gè)門(mén)，57個(gè)綱，149個(gè)目，239個(gè)科，422個(gè)屬，601個(gè)種，744個(gè)OTU。α多樣性分析可以反映樣本中微生物群落的豐富度和多樣性，α多樣性中包含能夠估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性的相關(guān)指數(shù)。由表2可知，細(xì)菌中覆蓋率均不小于99.97%，菌落的覆蓋率很高，說(shuō)明本次測(cè)序的樣品數(shù)據(jù)能夠覆蓋當(dāng)前沙棘酵素發(fā)酵液中細(xì)菌的種類(lèi)，完全能夠代表樣本中細(xì)菌的真實(shí)情況。在整個(gè)發(fā)酵階段，Shannon指數(shù)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，而Simpson指數(shù)變化趨勢(shì)正好與其相反，說(shuō)明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，群落的細(xì)菌多樣性逐漸豐富，在發(fā)酵后期達(dá)到最高；ACE指數(shù)和Chao指數(shù)反映的是群落的豐富度，這兩個(gè)指數(shù)也是逐漸增加，說(shuō)明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，沙棘酵素酵液中物種的種類(lèi)逐漸增多。

表2 細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial α diversity indexes

2.3.4 細(xì)菌OTU分布

根據(jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。由圖5可知，前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）含有OTU數(shù)分別為99、280、325，其中特有的OTU數(shù)分別為8、85、124。由此可見(jiàn)，隨著沙棘酵素自然發(fā)酵的進(jìn)行，OTU數(shù)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，說(shuō)明細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性在逐漸提高，這與多樣性指數(shù)的分析結(jié)果一致，說(shuō)明沙棘酵素在其自然發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中細(xì)菌群落變化較大。

圖5 沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌OTU Venn圖Fig.5 Venn diagram showing unique and shared bacterial OTU between three fermentation stages of sea buckthorn jiaosu

2.3.5 基于門(mén)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

在門(mén)水平上沙棘酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖6所示，在沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中共檢出744個(gè)OTU，25個(gè)門(mén)，422個(gè)細(xì)菌屬，其相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門(mén)共5種，分別為藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、Proteobacteria、未知細(xì)菌門(mén)（unclassified_k__norank_d__Bacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、Firmicutes。由圖6可知，Cyanobacteria是沙棘酵素整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的第一大絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占據(jù)主導(dǎo)作用，是沙棘酵素前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3個(gè)不同發(fā)酵階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度分別為93.28%、66.59%和35.40%；Proteobacteria為第2大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度為6.60%～33.29%，該菌門(mén)在植物土壤中較為常見(jiàn)[26-27]，可能是沙棘果在采摘過(guò)程中攜帶環(huán)境微生物所致。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在中期（F22_H）和后期（F22_Z）階段，該P(yáng)roteobacteria呈增加趨勢(shì)，由此也可以看出，沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的不均一性。

圖6 細(xì)菌群落在門(mén)水平上的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of bacterial communities at the phylum level

2.3.6 基于屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

在屬水平上沙棘酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖7所示，其相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬共有5種，分別為：norank_f__norank_o__Chloroplast、雷爾氏菌（Ralstonia）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia。在發(fā)酵前期（F22_Q），norank_f__norank_o__Chloroplast為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)到93.28%，雖然在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，該菌屬豐度逐漸減少，盡管在后期（F22_H）減少至35.39%。但是，該菌屬在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程占比卻始終處于優(yōu)勢(shì)地位，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Ralstonia也屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，在沙棘酵素自然發(fā)酵各階段相對(duì)豐度依次為1.43%（F22_Q）＜21.45%（F22_Z）＜29.37%（F22_H）；另一種優(yōu)勢(shì)菌屬為unclassified_k__norank_d__Bacteria，在各階段的相對(duì)豐度依次為0%（F22_Q）＜4.02%（F22_Z）＜27.98%（F22_H）。

圖7 細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of bacterial communities at the genus level

2.3.7 基于屬水平不同發(fā)酵階段熱圖分析

熱圖是以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成及物種的豐度信息，通過(guò)色塊顏色梯度展示樣本中不同物種的豐度變化情況[28]。由圖8可知，沙棘酵素自然發(fā)酵的3個(gè)不同階段的樣本有所差異，其中，分類(lèi)水平總相對(duì)豐度排在前10 位的菌屬分別為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Rhodococcus、Pelomonas、Anaerocolumna、Acinetobacter、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium。3個(gè)發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢(shì)菌屬相同，均為norank_f__norank_o__Chloroplast屬，在發(fā)酵前期、中期和后期3個(gè)階段占比分別為93.55%、67.67%和36.46%；除發(fā)酵后期（F22_H）第2優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__Mitochondria外，其他兩個(gè)階段（F22_Q、F22_Z）的第2大菌屬均為Ralstonia。不同發(fā)酵階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成具有一定差異性，雖然有些菌屬結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但是含量卻均有不同，說(shuō)明沙棘酵素發(fā)酵液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，這與細(xì)菌群落在屬水平上占比的分析結(jié)果一致。

圖8 細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.8 Heatmap of bacterial community structure at the genus level

2.3.8β多樣性分析

2.3.8.1 樣本層級(jí)聚類(lèi)分析

為研究沙棘酵素自然發(fā)酵不同階段群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系，對(duì)3個(gè)發(fā)酵階段群落距離矩陣進(jìn)行聚類(lèi)分析。如圖9所示，3個(gè)發(fā)酵階段可聚為兩類(lèi)，即F22_Q和F22_Z聚為一類(lèi)，F(xiàn)22_H聚為一類(lèi)，其中發(fā)酵前期（F22_Q）的優(yōu)勢(shì)菌屬為：norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia，相對(duì)豐度依次為93.28%、4.90%和1.43%；中期（F22_Z）為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，相對(duì)豐度依次為：66.59%、21.45%、4.02%、3.30%和1.41%；后期（F22_H）為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，相對(duì)豐度依次為35.39%、29.37%、27.98%、0.88%和0.95%。總體而言，在前期和中期發(fā)酵的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，原因可能是這兩個(gè)時(shí)期溶液的滲透壓比較大，而后期隨著微生物的生長(zhǎng)和代謝，使其環(huán)境發(fā)生變化[29]，從而細(xì)菌的豐度產(chǎn)生差異。

圖9 基于聚類(lèi)分析和屬水平沙棘酵素發(fā)酵樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.9 Analysis of bacterial community structure at the genus level in sea buckthorn jiaosu samples based on cluster analysis

2.3.8.2 沙棘酵素自然發(fā)酵液中細(xì)菌群落PCA

基于屬水平，對(duì)沙棘酵素發(fā)酵液中菌屬進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖10所示，PC1的貢獻(xiàn)率為28.68%，PC2的貢獻(xiàn)率為20.43%。在PCA中，各個(gè)點(diǎn)之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[30]。反之，樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成則越相似[31]。在3個(gè)平行樣本中，F(xiàn)22_Q的樣本之間距離非常小，表明發(fā)酵初始階段組內(nèi)的差異非常小，而F22_Z和F22_H組內(nèi)距離較大，說(shuō)明這兩個(gè)樣本的組內(nèi)差異較大，原因是中后期沙棘酵素發(fā)酵液的環(huán)境較復(fù)雜，菌屬分布不均勻所致；從整體看，這3個(gè)發(fā)酵階段組間差異較大，說(shuō)明沙棘酵素不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性比較大。根據(jù)圖10分組可知，發(fā)酵前期（F22_Q）和中期（F22_Z）聚為一類(lèi)，發(fā)酵后期（F22_H）聚為一類(lèi)，這與樣本層級(jí)聚類(lèi)分析結(jié)果相同。

圖10 細(xì)菌群落PCAFig.10 PCA plot of bacterial community

2.3.9 沙棘酵素發(fā)酵中還原糖、乙醇和pH值與優(yōu)勢(shì)菌屬間的相關(guān)性

由圖11可知，細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬與發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性。其中，沙棘酵素發(fā)酵前期的norank_f__norank_o__Chloroplast和norank_f__Mitochondria與還原糖含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而發(fā)酵中后期的Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria則正好相反，即與還原糖含量的變化呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值則呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明沙棘酵素自然發(fā)酵中norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria對(duì)發(fā)酵液中還原糖、乙醇和pH值的影響顯著。

圖11 沙棘酵素發(fā)酵過(guò)程中還原糖、乙醇和pH值與優(yōu)勢(shì)菌屬間的相關(guān)性熱圖Fig.11 Heatmap of the correlation between reducing sugar content,alcohol content, pH and dominant bacteria during the fermentation of sea buckthorn jiaosu

3 討 論

通過(guò)Illumina高通量測(cè)序方法，分析了沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌結(jié)構(gòu)及多樣性變化。結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)越來(lái)越復(fù)雜，菌株種類(lèi)越來(lái)越多。在發(fā)酵前期、中期和后期獨(dú)有OTU數(shù)分別為8、85和124，細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性在逐漸提高。其中，norank_f__norank_o__Chloroplast在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，雖然隨著發(fā)酵進(jìn)行，該菌屬呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，相對(duì)豐度由前期的93.28%降至中期的66.59%和后期的35.40%，而Ralstonia屬和unclassified_k__norank_d__Bacteria在中后期的相對(duì)豐度則持續(xù)升高。說(shuō)明該溫度下，這幾種菌屬較適宜此發(fā)酵液中的環(huán)境，特別是沙棘果較高的酸性條件，也可能是發(fā)酵前期，由于發(fā)酵液中的含糖量較高，導(dǎo)致微生物所處環(huán)境的滲透壓較高，而norank_f__norank_o__Chloroplast和norank_f__Mitochondria發(fā)酵前期豐富度較高的菌屬，能夠在此環(huán)境下較好利用糖類(lèi)物質(zhì)，但是隨著糖類(lèi)物質(zhì)的消耗，發(fā)酵液中滲透壓的降低，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生改變，其他微生物開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致微生物的結(jié)構(gòu)及多樣性變得豐富起來(lái)。由相關(guān)性分析可知，本研究中norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria等菌屬與沙棘酵素中還原糖、乙醇和pH值的相關(guān)性顯著。

沙棘酵素發(fā)酵中細(xì)菌群落來(lái)源可能與沙棘果在采摘時(shí)接觸土壤、樹(shù)體而帶來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境中微生物有關(guān)。此外，由于沙棘果漿在自然發(fā)酵前，尚未經(jīng)過(guò)滅菌處理，在解凍和打漿過(guò)程中也會(huì)有周?chē)h(huán)境中微生物的參與。在發(fā)酵前期（F22_Q），細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較單一，以norank_f__norank_o__Chloroplast為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，其次有少量的norank_f__Mitochondria和Ralstonia；在發(fā)酵中后期，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異性；而通過(guò)細(xì)菌OTUVenn圖可知，細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，從而更有力的展示了沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。很多植物類(lèi)酵素在自然發(fā)酵中，其微生物的結(jié)構(gòu)和豐度都會(huì)有非常明顯的變化，例如，黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過(guò)程中，在發(fā)酵0～20 d細(xì)菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高，在發(fā)酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對(duì)較高，在其自然發(fā)酵中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為L(zhǎng)actobacillus[27]；蘋(píng)果自然發(fā)酵酵素中的細(xì)菌多樣性前期最高，呈先降低后升高的趨勢(shì)，細(xì)菌主要有Lactobacillus、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、明串珠菌（Leuconostoc）和醋酸菌（Acetobacter）[32]；在大頭菜發(fā)酵過(guò)程中，Proteobacteria和Firmicutes占據(jù)了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，在發(fā)酵前期，Vibrio為優(yōu)勢(shì)菌屬，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，弧菌屬相對(duì)豐度急劇下降，Halanaerobium成為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，而Halomonas、Chromohalobacter和norank＿f＿TBZ33也是發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌屬[17]。由此可見(jiàn)，植物酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中，由于原料不同，發(fā)酵條件差異較大，所涉及的微生物種類(lèi)多，在不同發(fā)酵階段各種微生物的作用以及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序?qū)ι臣退刈匀话l(fā)酵前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3個(gè)時(shí)期樣本進(jìn)行分析，根據(jù)分類(lèi)單元個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)得744個(gè)OTU，25個(gè)門(mén)，42個(gè)細(xì)菌屬。在門(mén)水平上共有5種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，分別為Cyanobacteria、Proteobacteria、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Acidobacteriota、Firmicutes，其中，Cyanobacteria為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在3個(gè)發(fā)酵階段的相對(duì)豐度分別為93.28%、66.59%和35.40%；在屬水平上共有5種優(yōu)勢(shì)菌，分別為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，其中，norank_f__norank_o__Chloroplast菌屬在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程相對(duì)豐度均處于領(lǐng)先地位，其相對(duì)豐度范圍為35.39%～93.28%；通過(guò)β多樣性中的樣本層級(jí)聚類(lèi)分析和PCA得出，3個(gè)發(fā)酵階段可聚為兩類(lèi)，F(xiàn)22_Q和F22_Z聚為一類(lèi)，F(xiàn)22_H為一類(lèi)。這為后續(xù)沙棘酵素的發(fā)酵提供重要理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)沙棘酵素的生產(chǎn)工藝等具有深遠(yuǎn)影響。本研究揭示了沙棘酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)演替，為研制高效酵素發(fā)酵劑，提高沙棘酵素產(chǎn)品質(zhì)量提供了的理論基礎(chǔ)。