張紅 吳昊2 姜磊2 魯曉晴

(1 青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)華賽醫(yī)學(xué)細(xì)胞和蛋白質(zhì)藥物研究院)

自然殺傷(NK)細(xì)胞是機(jī)體重要的先天性免疫細(xì)胞，也是抵御病毒感染或者惡性腫瘤的第一道防線[1]。NK細(xì)胞主要分布在外周血中，占外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的比例為5%～20%，在腫瘤患者體內(nèi)，其抗腫瘤免疫的作用會(huì)受到限制[2-3]。因此必須在體外擴(kuò)增培養(yǎng)大量有活性的NK細(xì)胞以滿足患者臨床治療的需要。

研究表明，細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞影響各不相同，多細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用能更好促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和活化[4-9]。然而如何對(duì)影響NK細(xì)胞增殖活化的因素進(jìn)行選擇和優(yōu)化，從而達(dá)到最佳效果，迄今為止，尚無(wú)一致結(jié)論。本研究首先從NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量、表型以及功能實(shí)驗(yàn)等方面對(duì)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期為NK細(xì)胞免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)；然后再通過(guò)磁性細(xì)胞分選(MACS)技術(shù)獲得不同培養(yǎng)階段純化后的NK細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)分析[10-11]，進(jìn)一步探討NK細(xì)胞體外增殖活化的信號(hào)通路，為基于NK細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于美國(guó)Alere公司，IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D生物科技公司，重組人IL-2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18、rhIL-21和抗人CD16單克隆抗體均為同立海源生物科技有限公司產(chǎn)品；鼠抗人CD56、CD3流式抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司，免疫磁珠、分選器以及分選柱均購(gòu)于德國(guó)Miltenyi公司，腫瘤細(xì)胞株K562-GFP購(gòu)買于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

選取健康志愿者6例(健康體檢者，男女不限，年齡18～45歲)，每例志愿者均無(wú)菌采集外周血50 mL作為樣本，分離PBMC，每例樣本的PBMC分別使用包被過(guò)CD16抗體的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶以密度1.5×109個(gè)/L進(jìn)行培養(yǎng)，并且每瓶均加入5 mL人淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.05的人滅活自體血清，以及體積分?jǐn)?shù)0.001的rhIL-2、體積分?jǐn)?shù)0.003的rhIL-12、體積分?jǐn)?shù)0.002 5的rhIL-15、體積分?jǐn)?shù)0.005的rhIL-18、體積分?jǐn)?shù)0.001的rhIL-21)；每2～3 d補(bǔ)充上述培養(yǎng)液一次，并在第0、3、5、7、10和14天時(shí)對(duì)每例樣本的培養(yǎng)液在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的擴(kuò)增情況；分別于第0、10、14天收集每例樣本的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)表型和功能實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。采用含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中對(duì)腫瘤細(xì)胞株K562-GFP進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞備用。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表型

收集每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×109個(gè)/L，將上述細(xì)胞熒光標(biāo)記CD3-APC、CD56-PE抗體，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NK細(xì)胞均設(shè)置同型的IgG陰性對(duì)照，在4 ℃條件下避光孵育20 min后，使用PBS漂洗2次，加入100 μL PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析NK細(xì)胞表型，即CD3-CD56+細(xì)胞所占比例。

1.4 NK細(xì)胞體外殺傷活性檢測(cè)

取生長(zhǎng)旺盛的K562-GFP靶細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L，在12孔板上根據(jù)效靶比依次為5∶1、10∶1和 20∶1加入相應(yīng)細(xì)胞密度的NK效應(yīng)細(xì)胞(每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的NK細(xì)胞)，同時(shí)設(shè)置只有K562-GFP靶細(xì)胞的對(duì)照孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組NK細(xì)胞的殺傷活性。殺傷活性的計(jì)算公式：[(對(duì)照組K562-GFP活細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組K562-GFP活細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組K562-GFP活細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.5 ELISA方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞IFN-γ的分泌情況

提取每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的NK細(xì)胞，以ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞中IFN-γ的分泌情況，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NK細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.6 純化NK細(xì)胞并行RNA-seq和基因富集分析

根據(jù)上述對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表型和功能實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，篩選出最優(yōu)的3例志愿者樣本，篩選標(biāo)準(zhǔn)為NK細(xì)胞純度、殺傷活性以及IFN-γ分泌量均較高者。分別收集這3例最優(yōu)志愿者體外培養(yǎng)第0、10、14天的細(xì)胞進(jìn)行MACS，先用CD3磁珠進(jìn)行陰性分選，再用CD56磁珠進(jìn)行陽(yáng)性分選，獲得純化后的NK細(xì)胞，即CD3-CD56+細(xì)胞，計(jì)算NK細(xì)胞的純化效率(3例樣本不同時(shí)間純化效率的平均值)。對(duì)每例樣本每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)純化后的NK細(xì)胞分別進(jìn)行RNA-seq分析，委托北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。對(duì)RNA-seq結(jié)果，以|log2(Fold Change)|>2且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞中差異表達(dá)基因(DEGs)，并對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增情況以及表型分析

從第1天開(kāi)始，體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變亮變圓，逐漸出現(xiàn)抱團(tuán)聚集現(xiàn)象。NK細(xì)胞在培養(yǎng)前5 d生長(zhǎng)較為緩慢，最快增殖時(shí)間為培養(yǎng)的第7～14天(圖1)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第10天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到(37.27±4.29)×106個(gè)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第14天時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到(48.93±4.43)×106個(gè)。使用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)至第0、10、14天時(shí)NK細(xì)胞(CD3-CD56+)的比例，結(jié)果詳見(jiàn)圖2A～C，其中Q1區(qū)為NK細(xì)胞所在區(qū)域，第14天時(shí)NK細(xì)胞(CD3-CD56+)的比例超過(guò)90%。

A～C分別為培養(yǎng)第0、10、14天的NK細(xì)胞圖1 NK細(xì)胞體外擴(kuò)增情況Fig.1 In vitro amplification of NK cells

A～C分別為流式細(xì)胞儀檢測(cè)第0、10、14天時(shí)NK細(xì)胞(CD3-CD56+)所占比例圖2 NK細(xì)胞表型檢測(cè)Fig.2 NK cell phenotype

2.2 NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性分析

析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，時(shí)間、效靶比、時(shí)間和效靶比交互對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性均有顯著影響(F時(shí)間=4 086.28，F(xiàn)效靶比=2 857.25，F(xiàn)時(shí)間*效靶比=341.18，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，在效靶比相同時(shí)，第10天和第14天時(shí)NK細(xì)胞殺傷活性均較第0天明顯增強(qiáng)，在同一時(shí)間點(diǎn)，不同效靶比的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性比較差異具有顯著性(F=124.40～5 512.00，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞IFN-γ的分泌情況比較

檢測(cè)結(jié)果顯示，第0、10、14天時(shí)NK細(xì)胞IFN-γ分泌量分別為(1.42±0.13)、(41.22±1.18)和(45.85±1.23)μg/L，不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有顯著性(F=1 697.00，P<0.05)，其中第14天與第0、10天時(shí)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=67.17、7.75，P<0.05)。

表1 不同效靶比和不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性比較Tab.1 Comparison of killing activity of NK cells against K562 cells at different effector/target ratios and different time points

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞純化效率

檢測(cè)結(jié)果顯示，這3例最優(yōu)志愿者不同時(shí)間點(diǎn)的NK細(xì)胞經(jīng)過(guò)MACS純化以后，NK細(xì)胞(CD3-CD56+)的比例達(dá)到(94.69±1.33)%。

2.5 不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞的RNA-seq分析結(jié)果

RNA-seq分析結(jié)果顯示，與第0天相比，培養(yǎng)至第10天時(shí)NK細(xì)胞中上調(diào)DEGs有1 458個(gè)，下調(diào)DEGs有1 748個(gè)；與第0天相比，培養(yǎng)至第14天時(shí)NK細(xì)胞中上調(diào)DEGs有1 077個(gè)，下調(diào)DEGs有1 103個(gè)。與第10天相比，培養(yǎng)至第14天時(shí)NK細(xì)胞中上調(diào)DEGs有0個(gè)，下調(diào)DEGs有4個(gè)。GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，這些DEGs主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖相關(guān)，而且顯著富集在細(xì)胞周期、成骨細(xì)胞分化、造血細(xì)胞調(diào)控、NF-Kappa B等信號(hào)通路上。

3 討 論

NK細(xì)胞活化是指通過(guò)IL等外界因子的刺激作用，使NK細(xì)胞比作用前具有更強(qiáng)的殺傷活性，從而使機(jī)體在抗病毒感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[12]。由于目前對(duì)NK細(xì)胞活化相關(guān)基因組信息的研究有限，導(dǎo)致對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和功能調(diào)控的許多機(jī)制均不明了，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。本研究通過(guò)MASC方法獲得純化后不同培養(yǎng)時(shí)間的NK細(xì)胞并進(jìn)行RNA-seq分析，篩選出DEGs，為探討NK細(xì)胞活化的基因表達(dá)通路以及進(jìn)一步解決臨床應(yīng)用中所遇到的問(wèn)題，提供研究方法和手段。

本研究中NK細(xì)胞體外擴(kuò)增情況和表型分析結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第14天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到(48.93±4.43)×106個(gè)，NK細(xì)胞(CD3-CD56+)的比例超過(guò)90%，這表明該培養(yǎng)方法不僅可以有效誘導(dǎo)PBMC成為NK細(xì)胞，使其大量增殖并且保證了擴(kuò)增純度。NK細(xì)胞殺傷活性和IFN-γ分泌量檢測(cè)結(jié)果顯示，第10、14天NK細(xì)胞殺傷活性較第0天明顯增強(qiáng)，在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著效靶比提高，殺傷活性均逐步增強(qiáng)；培養(yǎng)至第14天的NK細(xì)胞IFN-γ分泌量均高于第10、0天。這表明該培養(yǎng)方法可以提高NK細(xì)胞的殺傷活性和細(xì)胞毒作用。本研究建立的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，無(wú)需飼養(yǎng)層細(xì)胞，也無(wú)需基因改造，就可直接從PBMC中獲得高質(zhì)量、高殺傷活性和高擴(kuò)增倍數(shù)的NK細(xì)胞，從而提高了NK細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性[13-16]。本研究RNA-seq結(jié)果顯示，第10、14天NK細(xì)胞與第0天NK細(xì)胞比較，DEGs均增多，且第10天DEGs多于第14天，表明在現(xiàn)有培養(yǎng)方案下，體外培養(yǎng)至第10天的NK細(xì)胞處于增殖活化的關(guān)鍵時(shí)期，到第14天時(shí)NK細(xì)胞已經(jīng)處于平臺(tái)期。第10天和第14天NK細(xì)胞相比只有4個(gè)DEGs，表明這兩組的組間差異較小，樣本間表達(dá)模式的相似度較高。GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果均顯示，這些DEGs與炎癥反應(yīng)相關(guān)，這表明炎癥反應(yīng)可能在NK細(xì)胞活化發(fā)揮作用方面扮演著重要角色。

本研究的創(chuàng)新之處在于首先通過(guò)建立NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，比較分析健康人NK細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的擴(kuò)增情況、殺傷活性和細(xì)胞毒性，探討該培養(yǎng)方法對(duì)于NK細(xì)胞體外增殖活化不同時(shí)期的影響，對(duì)未來(lái)臨床NK細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)提供參考。此外通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)純化后NK細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，了解不同培養(yǎng)階段NK細(xì)胞的基因表達(dá)情況，為后續(xù)深入研究NK細(xì)胞的特性、探討體外增殖活化潛在的分子調(diào)控機(jī)制提供了研究方法和研究手段。

目前NK細(xì)胞活化的途徑有兩種假說(shuō)，即“喪失自我”和“壓力誘導(dǎo)”[17-19]?；罨腘K細(xì)胞通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮功能，許多研究表明炎癥反應(yīng)與NK細(xì)胞的活化密切相關(guān)[20-22]。本研究的GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果也顯示這些DEGs與炎癥反應(yīng)相關(guān)，因此本文重點(diǎn)探討和炎癥反應(yīng)有關(guān)的NF-Kappa B信號(hào)通路。事實(shí)上，通過(guò)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子使NK細(xì)胞活化，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的治療手段已經(jīng)應(yīng)用于臨床[23-24]。研究表明NF-Kappa B信號(hào)通路的特異性阻斷劑MG132可以部分下調(diào)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并同時(shí)抑制NK細(xì)胞的增殖，這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ、FASL、perforin等殺傷分子的表達(dá)從而發(fā)揮其調(diào)控NK細(xì)胞活化的作用[25]。然而，關(guān)于調(diào)控NK細(xì)胞活化的具體細(xì)節(jié)并不清楚，還需要進(jìn)一步的探索和研究。

本研究也存在一些局限性，如樣本量較小，無(wú)法更好地設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，并且只是在生物信息學(xué)分析下的理論研究，下一步還應(yīng)進(jìn)行一些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，從而進(jìn)一步闡明NK細(xì)胞體外活化的具體機(jī)制和作用。

綜上所述，本研究從方法學(xué)的角度探索CD16抗體聯(lián)合5種細(xì)胞因子體外擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞方法的有效性，并在NK細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量、表型檢測(cè)和功能實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行驗(yàn)證，為NK細(xì)胞免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為進(jìn)一步解決臨床應(yīng)用所遇到的問(wèn)題提供研究方法和手段。另外，本研究還通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)純化后的NK細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，尋找與維持NK細(xì)胞增殖活化相關(guān)的信號(hào)通路,為基于NK細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QDU-HEC-2022163)。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee of Qingdao University Faulty of Medicine (Approval Letter No. QDU-HEC-2022163, and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of Declaration Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：張紅、魯曉晴、姜磊、吳昊參與了研究設(shè)計(jì)；魯曉晴、張紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byZHANGHong,LUXiaoqing,JIANGLei,andWUHao. The manuscript was drafted and revised byLUXiaoqingandZHANGHong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.