陸文江，劉雨辰，高 想，蘇憶玲，王 力，陸 齊

心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展到嚴(yán)重階段的臨床綜合征，嚴(yán)重威脅人類健康，且具有高患病率、高花費和預(yù)后差的特點，是嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。隨著介入技術(shù)的進步和新型溶栓藥物的應(yīng)用，心肌梗死后心力衰竭越來越常見。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭的基本病理機制為心氣虛乏、心陽式微、瘀阻水停[3]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)心力衰竭的描述基本一致?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血液在體內(nèi)運行主要是通過心臟推動的，由于心臟血管減少，纖維化增加，心臟泵血功能受損，導(dǎo)致心力衰竭[4]，因此，促進血管新生、抑制纖維化顯得極為重要。目前，臨床治療心力衰竭的藥物主要分為強心苷和非強心苷[5]。然而，這些藥物治療心力衰竭作用有限，因而，尋找治療心力衰竭的新型藥物具有重要的臨床意義。

中醫(yī)學(xué)對心力衰竭的認(rèn)識與治療研究有數(shù)千年的歷史，積累了寶貴的經(jīng)驗。利心沖劑為朱良春大師苦心研究數(shù)十年的經(jīng)典處方，由益母草、葶藶子、補骨脂、黃精和黃芪組成，針對心氣虛乏、心陽式微、瘀阻水停心力衰竭的病理變化，以黃芪和黃精補心氣，補骨脂溫陽氣、振腎氣治其本；以益母草益氣活血利水，葶藶子瀉肺利水、通利水停瘀阻治其標(biāo)[6]。利心沖劑診治心力衰竭的臨床實踐中取得了顯著的療效[7]，但利心沖劑的作用機制尚未明確。本研究通過檢測心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌組織沉默調(diào)節(jié)蛋白3(SIRT3)/6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶3(PFKFB3)/缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達，探討利心沖劑促進心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌血管新生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級C57BL/6J雄性小鼠250只，鼠齡均為8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自南通大學(xué)動物房[合格證號：SCXK(滬)2017-0005]。動物實驗符合南通大學(xué)動物倫理委員會要求，倫理審查批號為S20190520-011。

1.2 實驗藥物與試劑 利心沖劑由益母草、黃精、葶藶子、補骨脂、黃芪免煎顆粒按10∶5∶4∶4∶10調(diào)和而成(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號分別為18122691，19030231，19010271，18111191，18120871)，均購自南通市中醫(yī)院中藥房；美托洛爾(阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，批號H32025391)；SIRT3(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號GB11354)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF，武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號GB11034)；HIF-1α(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號GB11031)；PFKFB3(美國Abcam公司，批號AB181861)；一抗、二抗(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號GB23301)；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白試劑盒(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號G2026)；凝膠配制盒(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號G2003)；蛋白Marker(美國Therm公司生產(chǎn)，批號26616)；RNA提取液(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號G3013)；異丙醇(昆山裕隆化工生產(chǎn)，批號80109218)。

1.3 實驗儀器 酶標(biāo)檢測儀(Rayto公司，型號Rt2100c)；電子天平(蘇州克瑞斯公司，型號PX125DH)；冷凍離心機(美國heal force公司，型號neofuge 13R)；電泳儀(美國BIO-RAD公司，型號1645050)；轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司，型號170-4070)；冰箱(西門子，型號BCD-186)；掃描儀(美國EPSON公司，型號V300)；勻漿儀(日本PRO公司，型號01-02300PC)；高速離心機(中國凱達公司，型號KH19A)；熒光定量酶聯(lián)免疫吸附(RT-qPCR)儀(美國ABI公司，型號Stepone plus)；超純水機(宏森科技公司，型號VE-10LH-E11)；小動物心臟彩超(加拿大VisualSonics公司，型號Vevo?1100)。

1.4 動物模型制備 C57BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，行左冠狀動脈前降支結(jié)扎手術(shù)或?qū)φ帐中g(shù)。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。將氣體麻醉(異氟烷)后小鼠固定在手術(shù)臺上，乙醇消毒切口。在小鼠左胸部切一1.0 cm切口，鈍性分離胸部肌肉，在心臟搏動最明顯處使用血管鉗分離肋間隙，同時將心臟迅速擠出，分離心包；于左心耳下1 mm處，以6-0 proline絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，進針時不要刺破心臟；將心臟快速回納胸腔，擠出胸內(nèi)血氣，絲線關(guān)胸，即刻采用小動物心電圖儀測量小鼠心電圖，心電圖可見Ⅱ?qū)?lián)ST段較手術(shù)前抬高0.2 mV以上視為造模成功；摘除麻醉面罩，小鼠1 min內(nèi)蘇醒。對照組給予相同手術(shù)但只穿線不結(jié)扎前降支。

1.5 分組、給藥方法 C57BL/6J雄性小鼠結(jié)扎左前降支構(gòu)建心肌梗死模型，4周后通過小鼠心臟彩超檢測心力衰竭指標(biāo)排除非心力衰竭小鼠。將小鼠隨機分為對照組、模型組、利心沖劑低劑量組(28 g/kg)、利心沖劑高劑量組(56 g/kg)和美托洛爾組(0.06 g/kg)，各20只小鼠。給藥組小鼠給藥方式為灌胃，對照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃。各組小鼠連續(xù)給藥4周，每日1次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 心功能指標(biāo) 采用小動物心臟彩超測定小鼠心功能，包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.6.2 小鼠體質(zhì)量和心臟體質(zhì)量比 使用異氟烷麻醉小鼠后，采用電子天平分別稱取各組小鼠體質(zhì)量，之后處死小鼠取出心臟，擠出血液，使用生理鹽水充分漂洗沾干水分，分別稱取各組小鼠心臟重量，計算心臟體質(zhì)量比，之后將心臟置入-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.6.3 小鼠心肌四氮唑(TTC)染色 取出小鼠心臟，使用自來水洗凈血液，吸干水分后置入-80 ℃冰箱10 min。取出后延左室長軸切成1 mm薄片加入TTC染料，置于37 ℃水浴箱中水浴20 min，取出后甲醛固定，體視顯微鏡拍照。使用Image J處理圖像，白色部分為梗死區(qū)，梗死區(qū)面積除以心肌總面積計算梗死比，同時進行組間比較。

1.6.4 Masson染色 將小鼠心肌切片脫蠟后使用自來水與蒸餾水依次沖洗，應(yīng)用Regaud蘇木精染色6 min，之后蒸餾水洗5 min，復(fù)染8 min。2%冰醋酸洗10 s，置于1%水溶磷鉬酸液中4 min；直接應(yīng)用苯胺藍染5 min；再以2%冰醋酸水溶液浸洗；最后用中性樹膠封固拍片，藍色為纖維組織采用Image J處理，纖維化面積除以心肌總面積計算纖維化占比，同時進行組間比較。

1.6.5 蘇木精-伊紅(HE)染色 取心肌石蠟切片60 ℃烤片2 h，趁熱將其移入二甲苯Ⅰ、Ⅴ中脫蠟2 h，分別采用二甲苯Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ脫蠟過夜。采用100%，95%，90%，80%乙醇梯度水化，每次5 min，再使用蒸餾水漂洗3次，每次5 min。染色(蘇木素)10 min，沖洗3 min，后分化10 s(1%鹽酸乙醇)，再次沖洗 5 min，復(fù)染 3 min(伊紅)，沖洗 1 min。依次使用80%，90%，95%，100%乙醇脫水，每次 5 min，待乙醇揮發(fā)后封片，使用顯微鏡觀察小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)改變。

1.6.6 免疫組化CD31染色 將待檢組織用4%的多聚甲醛室溫固定過夜，固定好組織，使用薄刀片切成約2 mm薄片，加入目標(biāo)抗體(CD31抗體)產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)。CD31染色后，可見被CD31染成棕色的陽性細(xì)胞。計數(shù)血管密度(MVD)。人工計算5張圖片棕色點數(shù)，之后總點數(shù)除以5張圖片總面積得到單位血管點數(shù)，取平均值作為MVD。

1.6.7 RT-qPCR檢測小鼠心肌炎性因子白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達 取心肌組織約100 mg，按步驟提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄，使用RT-qPCR 儀進行擴增，預(yù)變性，95 ℃ 1 min；PCR反應(yīng)，40個循環(huán)，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，內(nèi)參基因為GAPDH，轉(zhuǎn)錄水平采用公式2-△△Ct計算。引物均由武漢Servicebio公司設(shè)計合成：GAPDH正向引物為CCTCGTCCCGTAGACAAAATG，反向引物為TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT；IL-6正向引物為TTCTTGGGACTGATGCTGGTG，反向引物為GCCATTGCACAACTCTTTTCTC；TNF-α正向引物為CCCTCACACTCACAAACCACC，反向引物為GCCATTGCACAACTCTTTTCTC；NF-κB正向引物為AAGCACAGATACCACCAAGACAC，反向引物為CGCACTGCATTCAAGTCATAGTC。

1.6.8 蛋白免疫印跡法測量心肌組織SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達 將心肌組織應(yīng)用冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，漂洗干凈后切成小塊置入勻漿管中徹底勻漿。以12 000 r/min離心10 min，收集上清液。測定上清液蛋白濃度，以4∶1比例加入緩沖液，使用100 ℃開水變性15 min，置入冰箱備用。按實驗所需配液，配電泳液加入目的蛋白電泳2 h之后濕轉(zhuǎn)膜90 min，使用牛奶封閉2 h取膜TBST沖洗2 min，孵一抗過夜之后用TBST將膜沖洗干凈，避光孵二抗2 h再用TBST洗膜，配熒光液拍照，分別用PhotoShop和Alpha軟件分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 實驗完成情況 喂養(yǎng)、給藥過程中，對照組2只小鼠死亡，模型組10只小鼠死亡，利心沖劑低劑量組6只小鼠死亡，利心沖劑高劑量組3只小鼠死亡，美托洛爾組3只小鼠死亡。

2.2 各組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD比較 與對照組比較，模型組小鼠LVEF、LVFS降低，LVEDD、LVESD升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組小鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組小鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 各組小鼠心臟彩超圖(×200)

表1 各組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD比較(±s)

2.3 各組小鼠體質(zhì)量、心臟重量和心臟體質(zhì)量比比較 與對照組比較，模型組體質(zhì)量下降，心臟重量增加，心臟體質(zhì)量比升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組體質(zhì)量增加，心臟重量和心臟體質(zhì)量比降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組體質(zhì)量增加，心臟重量和心臟體質(zhì)量比降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、心臟重量和心臟體質(zhì)量比比較(±s)

2.4 各組小鼠TTC染色改變 與對照組比較，模型組梗死區(qū)比例明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組梗死區(qū)比例降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組梗死區(qū)比例降低(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組小鼠梗死區(qū)TTC染色圖(×200)

表3 各組小鼠梗死區(qū)比例比較(±s) 單位：%

2.5 各組小鼠Masson染色改變 與對照組比較，模型組Masson染色最深，心肌纖維化最嚴(yán)重(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組Masson染色改善明顯，心肌纖維化減輕(P<0.01)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組Masson染色減輕最明顯，心肌纖維化最輕(P<0.01)。詳見圖3、表4。

圖3 各組小鼠心肌纖維化改變Masson染色圖(×200)

表4 各組小鼠心肌纖維化比例比較(±s) 單位：%

2.6 各組小鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)改變 模型組小鼠心肌細(xì)胞由正常的圓形或橢圓形變?yōu)殚L桿狀且排列紊亂，可見細(xì)胞碎裂、壞死。利心沖劑各劑量組心肌細(xì)胞排列相對規(guī)則，細(xì)胞碎裂、壞死相對較少，其中利心沖劑高劑量組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞碎裂、壞死最少，與美托洛爾組形態(tài)相似。詳見圖4。

圖4 各組小鼠心肌組織HE染色圖(×200)

2.7 各組小鼠免疫組化CD31染色改變 與對照組比較，模型組MVD減少(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組MVD增加(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組MVD增加(P<0.05)。詳見圖5、表5。

圖5 各組小鼠免疫組化CD31染色圖(MVD，×200)

表5 各組小鼠MVD比較(±s) 單位：個/高倍鏡

2.8 各組小鼠血清 IL-6、TNF-α、NF-κB比較 與對照組比較，模型組IL-6、TNF-α、NF-κB水平升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組小鼠IL-6、TNF-α、NF-κB水平降低(P<0.01)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組IL-6、TNF-α、NF-κB明顯降低(P<0.01)。詳見表6。

表6 各組小鼠心肌IL-6、TNF-α、NF-κB比較(±s)

2.9 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達比較 與對照組比較，模型組小鼠SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，利心沖劑低劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達增加(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達增加最明顯(P<0.05)。詳見圖6、表7。

圖6 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達條帶圖(A為對照組；B為模型組；C為利心沖劑低劑量組；D為利心沖劑高劑量組；E為美托洛爾組)

表7 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達水平比較(±s)

3 討 論

本研究探討利心沖劑治療心肌梗死后心力衰竭小鼠的可能機制。結(jié)果顯示，利心沖劑可能通過激活SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號通路，促進心肌梗死后心力衰竭小鼠血管新生[8-9]，且與美托洛爾作用相似，本研究選擇美托洛爾是由于其為臨床抗心力衰竭的常用藥，且具有促血管新生的作用。

SIRT3是與人類壽命長短有關(guān)的因子，可調(diào)節(jié)體內(nèi)線粒體代謝等生理活動[10]。已有研究表明，SIRT3通過磷酸化調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3表達，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解，正常情況下糖酵解是內(nèi)皮細(xì)胞獲取能量的主要方式[11]，也是內(nèi)皮細(xì)胞進行遷移和增殖的主要能量來源，通過調(diào)節(jié)糖酵解影響內(nèi)皮細(xì)胞血管新生[12-13]。PFKFB3與HIF-1α存在正反饋調(diào)節(jié)，HIF-1α與VEGF啟動子結(jié)合促進VEGF轉(zhuǎn)錄[14-15]和血管生成[16]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，利心沖劑各劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α、VEGF蛋白表達增多，血管新生增加，其中利心沖劑高劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α、VEGF蛋白表達最多，血管新生明顯，且與美托洛爾組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，推測利心沖劑可能通過SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號通路，促進心肌梗死后心力衰竭小鼠血管新生，且具有劑量依賴性。既往研究顯示，PFKFB3/HIF-1α信號通路可促進炎性因子表達[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，利心沖劑各劑量組IL-6、TNF-α、NF-κB減少，其中利心沖劑高劑量組增加明顯，且與美托洛爾組作用相似。推測利心沖劑可能通過促進血管新生，進而改善心力衰竭小鼠組織氧供，抑制炎性因子表達[18-19]。利心沖劑可能通過其他通路直接抑制心肌炎性因子表達，需進一步研究明確。

目前血管新生和纖維化關(guān)系尚未明確，相關(guān)研究顯示，抑制血管新生，可抑制纖維化，尤其在肝臟、眼科方面的研究[20-21]。有研究表明，肝臟細(xì)胞中血管竇毛細(xì)血管增生，可促進肝細(xì)胞纖維化，門脈血管新生，抑制肝細(xì)胞纖維化[22]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組血管新生減少，纖維化增加；與模型組比較，利心沖劑各劑量組血管新生增多，纖維化降低，且具有劑量依賴性。推測利心沖劑可能通過SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號通路促進生理性血管新生，抑制纖維化。

綜上所述，利心沖劑可能通過激活SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號通路促進血管新生，但利心沖劑中何種成分促進血管新生，是否通過其他通路促進血管新生仍需進一步研究。