張 靜,張童生,李敬龍,邱 磊

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353

病原真菌改變自己的細(xì)胞形態(tài)來適應(yīng)新環(huán)境的現(xiàn)象是普遍存在的[1]。高度極化的多細(xì)胞菌絲態(tài)和單細(xì)胞的酵母態(tài)是最常見的細(xì)胞形態(tài),這兩種形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換對病原真菌的致病性和生命周期非常重要[2]。菌絲與分生孢子相結(jié)合,有利于真菌對抗各種惡劣環(huán)境并擴散生長。波薩達斯球孢子菌(Coccidioidesposadasii)是一種能引起肺球孢子菌病的致病菌,在宿主死亡后以菌絲形態(tài)生長在尸體和附近的土壤[3]。采用微衛(wèi)星位點分析不同地區(qū)的波薩達斯球孢子菌表明,南美的波薩達斯球孢子菌是由美國德克薩斯州的人類或其它哺乳動物南遷帶來的[4]。菌絲態(tài)還有利于病原真菌從體外侵染宿主,比如秕糠馬拉癬菌(Malasseziafurfur)和威尼克外瓶霉菌(Exophialawerneckii)采用菌絲形態(tài)侵入人類的表皮表層引起皮膚病[5]。當(dāng)病原真菌侵入宿主后,多存在于宿主的吞噬細(xì)胞中,在那里它們與免疫系統(tǒng)的其它部分隔絕。由于吞噬細(xì)胞內(nèi)菌絲的長期生長會導(dǎo)致細(xì)胞破裂,從而使真菌暴露在宿主免疫系統(tǒng)中,所以一些病原真菌會在宿主體內(nèi)由多細(xì)胞的菌絲生長轉(zhuǎn)換為單細(xì)胞的酵母生長[6]。還有一些病原真菌使用酵母細(xì)胞形態(tài)逃避宿主的免疫防御并改變宿主行為,偏側(cè)蛇蟲草菌(Ophiocordycepsunilateralis)的酵母樣細(xì)胞能夠侵入多刺蟻(Polyrhachisants)的肌肉或神經(jīng)系統(tǒng),控制螞蟻離開蟻穴,找到合適的葉子或樹枝后緊緊咬住后等待死亡[7]。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種國內(nèi)外廣泛使用的廣譜性昆蟲病原真菌,在我國主要用來防治馬尾松毛蟲和玉米螟,取得了良好的效果[8-10]。相對于化學(xué)殺蟲劑,球孢白僵菌主要有保護生態(tài)系統(tǒng)、對環(huán)境無污染、對人體無害等優(yōu)點。作為一種國內(nèi)外廣泛使用的昆蟲病原真菌,其與宿主的相互作用被當(dāng)作模式系統(tǒng)進行研究。球孢白僵菌一方面可以通過宿主的體壁、氣孔等途徑外部侵入,另一方面可以通過呼吸道和消化道等途徑內(nèi)部侵入[11]。在侵染循環(huán)中,球孢白僵菌主要經(jīng)歷了分生孢子,菌絲和芽生孢子三種形態(tài)[12]。分生孢子形態(tài)有利于球孢白僵菌隨風(fēng)擴散和黏附到宿主體表;菌絲形態(tài)有利于侵入宿主體壁和攝取營養(yǎng);芽生孢子形態(tài)會釋放細(xì)胞表面的碳水化合物,以逃避宿主免疫系統(tǒng)的檢測,有利于球孢白僵菌在宿主體內(nèi)的增殖[13]。

本次研究模擬了球孢白僵菌在侵染宿主時的形態(tài)轉(zhuǎn)換,具體為分生孢子萌發(fā)形態(tài),營養(yǎng)菌絲產(chǎn)孢形態(tài)和芽生孢子的繁殖形態(tài),通過RNA-Seq的手段尋找他們之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗中使用的菌株為球孢白僵菌B.bassianaARSEF 2860。

1.2 培養(yǎng)基的配置

SDAY培養(yǎng)基:4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉和2%瓊脂。

GB培養(yǎng)基:2%蔗糖、0.5%蛋白胨。

NLB培養(yǎng)基:4% 葡萄糖、0.4% 硝酸銨、 0.3% 磷酸二氫鉀和0.3% 硫酸鎂。

1.3 樣本的培養(yǎng)

產(chǎn)孢形態(tài):將新鮮的球孢白僵菌分生孢子放到0.02%的吐溫80中混合均勻,調(diào)到懸浮液濃度為107mL-1,取100 mL的孢子懸浮液涂布到含有玻璃紙的SDAY培養(yǎng)基上,在恒溫25 ℃,12 h光照12 h黑暗的環(huán)境下倒置培養(yǎng)6 d,取下玻璃紙上的菌絲快速放到液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱待用[14]。

萌發(fā)形態(tài):從在SDAY培養(yǎng)基上生長14 d的菌絲上收集新鮮分生孢子,用0.02%的吐溫80懸浮后在漩渦振蕩器上混勻,接種到GB培養(yǎng)基中使其終濃度為106mL-1。在25 ℃的搖床中培養(yǎng),通過血球計數(shù)板測量分生孢子的萌發(fā)率,當(dāng)萌發(fā)50%左右時終止培養(yǎng),離心收集菌體并用PBS洗滌兩次后吸干上清液,放入液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱中待用。

芽生孢子形態(tài):將新鮮球孢白僵菌菌絲接種到NLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,然后濾紙過濾除去菌絲,收集芽生孢子后調(diào)節(jié)菌液濃度為106mL-1,再重新接種到NLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,離心收集芽生孢子并用PBS緩沖液洗滌兩次后吸干上清液,放入液氮中速凍,然后放到-80 ℃冰箱中待用。

1.4 RNA的提取

將收集的樣品在液氮中研磨成粉末狀,然后取適量體積放入1.5 mL的離心管中,加入1 mL的Trizol,在漩渦震蕩儀上震蕩3 min后,在室溫下靜置5 min。把冷凍離心機調(diào)到4 ℃預(yù)冷,等溫度恒定后將離心管12 000 r/min離心10 min。取上清液至新的1.5 mL離心管,加入等體積的異戊醇上下顛倒混勻,在-20 ℃冰箱中靜置1 h后,在4 ℃離心機再次12 000 r/min離心15 min。棄上清,加入1 mL 75%乙醇,用移液槍吹洗沉淀。在4 ℃下10 000 r/min離心3 min,吸去上清液,放在冰上晾干。最后用30 μL DEPC水溶解沉淀[15]。

1.5 mRNA建庫與測序分析

本文章的建庫與測序分析交由華大基因公司負(fù)責(zé)。

2 結(jié)論和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析

利用華大基因的BGISEQ-500平臺,本項目對球孢白僵菌3種形態(tài)下的9個樣本(每種形態(tài)3個重復(fù)樣本)進行分析,每個樣本得到約6.5 GB的數(shù)據(jù)。每個樣本得到的clean reads數(shù)超過4千萬條(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析

2.2 三種形態(tài)下表達的基因差異

通過轉(zhuǎn)錄組測序,萌發(fā)形態(tài)表達了5 995個基因,產(chǎn)孢形態(tài)表達了6 083個基因,而芽生孢子形態(tài)下表達的基因數(shù)量最多,達到了6 137個基因,其中5 029個基因是三種形態(tài)下共同表達的 (FPKM>10,圖1)。基因表達數(shù)目最多的芽生孢子形態(tài)比基因表達數(shù)目最小的萌發(fā)形態(tài)只多了142個基因,占芽生孢子態(tài)基因表達數(shù)目的2.3%,說明三種形態(tài)下表達的基因數(shù)量差別并不大。每一種形態(tài)下都有自己獨特的表達基因,比如在萌發(fā)形態(tài)中MFS transporter(BBA_06426和BBA_04496),產(chǎn)孢形態(tài)中的chitinase(BBA_09998)和芽生孢子形態(tài)的nitric oxide dioxygenase(BBA_04638)。表2中按平均表達量從高到低展示了在每種形態(tài)下特異表達的前五個基因。

圖1 萌發(fā)、產(chǎn)孢和芽生孢子三種形態(tài)下基因表達的數(shù)目,篩選標(biāo)準(zhǔn)FPKM>10

表2 在每種形態(tài)下會特異表達的基因

表2(續(xù))

2.3 種形態(tài)下基因表達量差異性

將差異基因的閾值設(shè)置為log2FC>2,Qvalue<0.001來對3種形態(tài)下基因的表達量進行對比。萌發(fā)與產(chǎn)孢之間的差異基因數(shù)量最多(2 196個),產(chǎn)孢與芽生孢子有1 454個差異基因,萌發(fā)與芽生孢子有1 280個差異基因(圖2)。有236個基因會隨著球孢白僵菌形態(tài)的改變顯著改變自己的表達量,并且在每種形態(tài)下的表達量都不相同(圖2A)。對這236個基因進行GO富集分析,結(jié)果顯示有94個基因富集在catalytic activity,34個基因富集在了oxidoreductase activity,50個基因富集在與membrane相關(guān)的目錄(圖2B)。

3 結(jié) 論

球孢白僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換與其致病生理過程息息相關(guān),對其不同形態(tài)下基因表達水平的研究能讓我們更清楚的了解球孢白僵菌的生長與致病機理。本文通過轉(zhuǎn)錄組測序手段,去探索球孢白僵菌三種形態(tài)之間的區(qū)別與聯(lián)系,為后期的形態(tài)學(xué)研究打下了基礎(chǔ),同時指明了方向。我們下一步將從了解單個基因出發(fā),逐步破解球孢白僵菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的密碼,以期望有一天我們可以使用基因工程改造出理想的菌株。