王興蘭，張建勇

1 遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 貴州遵義 563006 2 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州遵義 563000

支氣管哮喘（Bronchial Asthma，簡稱哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的，以氣道高反應(yīng)性及氣流受限為主要特征的慢性炎癥性疾病[1]。作為全球最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，哮喘給患者、家庭、社會乃至整個國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)壓力，已成為危害人類身體和身心健康的主要社會公共衛(wèi)生問題之一[2]。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全明確，目前認(rèn)為氣道重塑和氣道炎癥是哮喘特征性病理改變[3]。1992年Koessler及Huber學(xué)者首次提出氣道重塑學(xué)說[4]，氣道重塑是哮喘最為典型的病理學(xué)特點(diǎn)，涉及炎癥細(xì)胞浸潤、新生血管形成、上皮下膠原蛋白的沉積及纖維化以及氣道平滑肌的增生、肥大等[5-7]。長期反復(fù)的氣道炎癥是導(dǎo)致哮喘氣道重塑的重要原因，持續(xù)進(jìn)展的氣道重塑最終可導(dǎo)致氣道阻塞的不可逆、肺功能的嚴(yán)重受損以及氣道高反應(yīng)性的持續(xù)存在[8]?！吧掀?間充質(zhì)營養(yǎng)單位學(xué)說”是至今較為認(rèn)可的學(xué)說之一，是指由多種炎癥細(xì)胞參與引起的炎癥刺激。該學(xué)說認(rèn)為，正常情況下促氣道上皮細(xì)胞修復(fù)的生長因子與抑制上皮細(xì)胞修復(fù)、促進(jìn)纖維增生的細(xì)胞因子處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)抑制上皮細(xì)胞修復(fù)、促進(jìn)纖維細(xì)胞增生的細(xì)胞因子處于優(yōu)勢地位時，便會導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞無法正常修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道纖維細(xì)胞發(fā)生活化、增生及纖維化，最終引起了氣道重塑[9]。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor beta，TGF-β）是由上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制氣道上皮細(xì)胞的修復(fù)、促進(jìn)纖維細(xì)胞增生的功能，是介導(dǎo)哮喘氣道重塑的重要介質(zhì)之一[10]。研究表明哮喘患者支氣管上皮中存在TGF-β1和TGF-β3表達(dá)，TGF-β1由肺內(nèi)成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)胞生長、分化、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且是導(dǎo)致氣道重塑的主要介質(zhì)[11-12]。

冬凌草是香茶菜屬植物，冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的一種天然化合物，占冬凌有效成分的百分之九十以上，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種功 能[13]，有學(xué)者對冬凌草甲素在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用進(jìn)行研究，陳葉等對雞卵蛋白（ovalbumin， OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型進(jìn)行研究，結(jié)果表明，冬凌草甲素可通過調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞1型（Th1）/輔助性T細(xì)胞2型（Th2）平衡、抑制氣道高反應(yīng)性來減輕急性哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)[14]。對于冬凌草甲素是否能減輕哮喘小鼠的氣道重塑，國內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究冬凌草甲素對急性哮喘小鼠氣道重塑的影響及可能的機(jī)制，為哮喘的診治提供新的思路。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級6～8周齡BALB/C雌性小鼠，體重（16～20g）（18.11±0.66g），由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK（渝）2012-0005]。

1.2 藥品與試劑 OVA（II級、V級，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），冬凌草甲素（上海士豐生物制品有限公司），二甲亞砜（北京中杉生物技術(shù)有限公司），實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）引物（TGF-β1、β-actin，大連TaKaRa公司），小鼠抗小鼠-TGF-β1單克隆抗體（英國Abcam公司），二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），RNAiso Reagent（大連TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司），SYBR? GREEN PCR Master Mix（大連TaKaRa公司），馬森（Masson）染色試劑盒（北京索來寶生物科技有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），焦碳酸二乙酯（DEPC）（大連TaKaRa公司），多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司），4%多聚甲醛（慶川東化工有限公司），無水乙醇、二甲苯、鹽酸（重慶川東化工有限公司）。

1.3 儀器 自制霧化箱（長27cm×寬24cm×高11cm），壓縮式霧化器NE-C900（歐姆龍大連有限公司），核酸蛋白測量儀ND-1000（美國Nanodrop公司），ICycler iQ5熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司），IPWin32采圖系統(tǒng)DM4000B（德國Lecia公司），Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 急性哮喘模型的建立 分別于實(shí)驗(yàn)第1天、第13天，腹腔（40ugOVA+1mg氫氧化鋁）聯(lián)合皮下注射（20ugOVA+1mg氫氧化鋁）致敏。第19～23d，將小鼠放于自制霧化箱內(nèi)，以超聲霧化器進(jìn)行霧化，10%OVA鹽水氣溶膠吸入激發(fā)，1次/d，每次30min，末次激發(fā)24h后處死小鼠。

2.2 分組給藥 分組：將清潔級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、冬凌草甲素10mg/kg干預(yù)組（低劑量干預(yù)組）、冬凌草甲素20mg/kg干預(yù)組（高劑量干預(yù)組）。實(shí)驗(yàn)組：致敏過程同模型組，低劑量干預(yù)組及高劑量干預(yù)組分別于激發(fā)前30min腹腔注10mg/kg及20mg/kg冬凌草甲素。正常組：致敏過程以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替OVA腹腔聯(lián)合皮下注射，激發(fā)過程以生理鹽水霧化吸入，相關(guān)參數(shù)與模型組相同。

2.3 對支氣管壁厚度進(jìn)行測定 氣道壁厚度測定參照加慧[15]等的方法，氣道壁厚度計(jì)算公式：氣道壁厚度（um）=（支氣管總面積—?dú)獾纼?nèi)徑面積）/支氣管基底膜的周徑。

2.4 馬森染色（Masson染色）觀察氣道周圍膠原纖維沉積 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用IPWin60彩圖系統(tǒng)及Image-proplus 6.0圖像分析軟件，定量分析氣道膠原纖維陽性相對面積。

2.5 應(yīng)用免疫組化檢測氣道TGF-β1表達(dá) 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以PBS代替一抗作空白對照，以小鼠大腸和脾臟分別作陽性和陰性對照，以PBS代替一抗作空白對照，以小鼠大腸和脾臟分別作陽性和陰性對照，以積分光密度（IOD）為指標(biāo)對各組免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行定量分析。

2.6 應(yīng)用熒光定量PCR檢測肺組織內(nèi)TGFβ1mRNA表達(dá)情況 先后完成總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)（SYBR Green Ⅱ嵌合熒光法）。TGF-β1引物序列上 游5，-GTGTGGAACATGTGGAACTCTA-3，下 游5，-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3， β-actin引 物序列上游5，-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3，下游5，-CAGCCTGGATGGCTACGTCA -3。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0軟件，根據(jù)資料屬性對各組數(shù)據(jù)完成統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊者使用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者使用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 各組小鼠氣道壁厚度

正常組：肺組織的結(jié)構(gòu)正常，氣管平滑肌及基底層無增厚，表面光滑。模型組：杯狀細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞增生、官腔狹窄、管壁增厚，氣道重塑顯著。干預(yù)組：支氣管壁的結(jié)構(gòu)較完整，可見少量平滑肌以及基底層的增厚，且低劑量干預(yù)組平滑肌及基底層增厚更明顯。測量氣道壁厚度，干預(yù)組、模型組與正常組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），干預(yù)組與模型組比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高劑量干預(yù)組與低劑量干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠氣道壁厚度（±s）

表1 各組小鼠氣道壁厚度（±s）

注：與正常組組比較，模型組及干預(yù)組P均＜0.01；與模型組組比較，干預(yù)組P均＜0.01，與低劑量干預(yù)組組比較，高劑量干預(yù)組P＜0.01。

組別 氣道壁厚度/μm正常組 36.96±5.08模型組 88.92±10.67低劑量干預(yù)組 70.46±9.33高劑量干預(yù)組 58.02±6.41

2 Masson染色檢測氣道組織膠原纖維表達(dá)情況

模型組、干預(yù)組氣道周圍的膠原纖維沉積相對面積均較正常組明顯增高（P＜0.01）。干預(yù)組氣道周圍的膠原纖維沉積相對面積均較模型組明顯減少（P＜0.01）。高劑量干預(yù)組氣道周圍膠原纖維沉積相對面積均較低劑量干預(yù)組顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果見表2，圖1-圖4。

圖4 高劑量干預(yù)組氣道組織膠原纖維表達(dá)

表2 各組小鼠氣道周圍膠原纖維陽性相對著色面積的變化（±s）

表2 各組小鼠氣道周圍膠原纖維陽性相對著色面積的變化（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預(yù)P均＜0.01；與模型組比較，干預(yù)組P均＜0.01，與低劑量干預(yù)組比較，高劑量干預(yù)組P＜0.01。

組別 氣道周圍膠原纖維沉積相對著色面積/%正常組 4.29±0.65模型組 22.36±1.56低劑量干預(yù)組 16.09±1.07高劑量干預(yù)組 11.49±0.99

3 免疫組化檢測TGF-β1蛋白的表達(dá)情況

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行檢測TGF-β1在肺組織的表達(dá)，TGF-β1主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及氣道黏膜上皮層。結(jié)果顯示正常組中TGF-β1僅弱表達(dá)，而在模型組、干預(yù)組中TGF-β1呈陽性表達(dá)，測IOD值均較正常組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組TGF-β1表達(dá)較干預(yù)組增加（P＜0.01）。低劑量干預(yù)組的TGF-β1表達(dá)量較高劑量干預(yù)組增加（P＜0.01）。結(jié)果見表3，圖5-圖8。

圖5 正常組肺組織TGF-β1

圖8 低劑量干預(yù)組肺組織TGF-β1表達(dá)

表3 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)（±s）

表3 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預(yù)P均＜0.01；與模型組比較，干預(yù)組P均＜0.01，與低劑量干預(yù)組比較，高劑量干預(yù)組P＜0.01。

組別 TGF-β1蛋白陽性著色面積正常組 0.07±0.01模型組 0.33±0.02低劑量干預(yù)組 0.21±0.01高劑量干預(yù)組 0.14±0.01

4 RT-PCR檢測小鼠氣道TGF-β1mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA表達(dá)，模型組、干預(yù)組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)量較正常組顯著增加（P＜0.01）。模型組肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)量顯著低于干預(yù)組（P＜0.01）；低劑量干預(yù)組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)量較高劑量干預(yù)組顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果見表4。圖9-圖12。

圖9 肺組織TGF-β1擴(kuò)增曲線圖

圖12 肺組織β-actin融解曲線峰圖

表4 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

表4 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：與正常組比較，模型組、干預(yù)P均＜0.01；與模型組比較，干預(yù)組P均＜0.01，與低劑量干預(yù)組比較，高劑量干預(yù)組P＜0.01

組別 ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT正常組 5.30±0.11 0±0.11 1.00±0.08模型組 3.71±0.13 -1.60±0.10 3.03±0.24低劑量干預(yù)組 3.96±0.13 -1.34±0.06 2.53±0.11高劑量干預(yù)組 4.25±0.12 -1.05±0.07 2.08±0.11

圖1 正常組氣道組織膠原纖維表達(dá)

圖2 哮喘組氣道組織膠原纖維表達(dá)

圖3 低劑量干預(yù)組氣道組織膠原纖維表達(dá)

討 論

哮喘是全球最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，是一種以氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性及氣道炎癥為主要特征的異質(zhì)性疾病[16]。氣道重塑是哮喘的特征性病理改變，是氣道在長期慢性炎癥反應(yīng)刺激下發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)改變，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可加重哮喘患者的癥狀、降低肺功能[17]。TGF-β1可促進(jìn)纖維細(xì)胞、肌層纖維細(xì)胞的增生，是氣道重塑的主要調(diào)控因子之一，與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。

冬凌草甲素是從冬凌草中提取的貝殼烯二萜類天然有機(jī)化合物，既往研究顯示冬凌草甲素具有抗腫瘤、抗增殖、抗炎和抗病毒等作用[18-19]。冬凌草甲素在我國治療炎癥性疾病已有數(shù)百年的歷史，是我國臨床使用最廣泛的中草藥之一。近年來有研究指出，冬凌草甲素可減輕哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性[14]，而冬凌草甲素是否能減輕支氣管哮喘的氣道重塑，目前國內(nèi)外暫無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同劑量冬凌草甲素對OVA誘導(dǎo)的急性哮喘小鼠的影響，采用HE染色觀察氣道壁厚度；Masson染色觀察氣道周圍膠原纖維沉積；免疫組化測定TGF-β1蛋白表達(dá)量，RT-PCR測定肺組織中TGFβ1mRNA表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，不同劑量的冬凌草甲素均可減輕哮喘小鼠氣道組織膠原纖維的增生、抑制TGF-β1的分泌，且高劑量冬凌草甲素干預(yù)組效果明顯優(yōu)于低劑量干預(yù)組，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。TGF-β1作為支氣管哮喘產(chǎn)生氣道重塑的主要調(diào)控因子，能促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生。由此推測冬凌草甲素可能通過抑制TGF-β1的分泌來減輕哮喘小鼠的氣道重塑，這一研究結(jié)果或?qū)橄闹委熖峁┬碌乃悸罚l(fā)揮我國中醫(yī)藥的優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入研究。

圖6 模型組肺組織TGF-β1表達(dá)

圖7 低劑量干預(yù)組肺組織TGF-β1表達(dá)

圖10 肺組織β-actin擴(kuò)增曲線圖

圖11 肺組織TGF-β1融解曲線圖