魯正剛，魏民，李琛，胡政偉，張恒柱

腦卒中是一種急性腦血管疾病,是由于腦部血管突然破裂，或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦相應(yīng)區(qū)域，而引起腦組織損傷的一組疾病,目前主要分為缺血性卒中和出血性卒中。腦卒中因其發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)，已成為危害中老年人群健康和生命的主要疾病，是全球第二大死亡原因，僅次于缺血性心臟病[1]?？焖倩謴?fù)腦血流量是缺血性卒中治療的首要目標(biāo)，也是神經(jīng)保護(hù)治療的前提。重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)靜脈溶栓是FDA批準(zhǔn)的治療急性缺血性腦卒中的唯一藥物。然而，由于rtPA治療窗口狹窄及其引起的再灌注損傷，只有5%的患者從rtPA治療中受益[2]，因此迫切需要新的治療措施來(lái)干預(yù)。壞死性凋亡是一種獨(dú)特的非半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)依賴(lài)的程序性死亡，在形態(tài)學(xué)上具有明顯的壞死特征。近年來(lái)，許多研究表明壞死性凋亡涉及腦卒中相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，并且通過(guò)干預(yù)壞死性凋亡信號(hào)通路，對(duì)包括缺血再灌注損傷、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等腦卒中相關(guān)疾病具有一定的保護(hù)作用，有望為治療這些疾病的藥物開(kāi)發(fā)提供潛在新靶點(diǎn)。因此，深入闡明壞死性凋亡信號(hào)通路與腦卒中之間的關(guān)系具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

1 壞死性凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

1.1 壞死性凋亡的誘導(dǎo) 壞死性凋亡可由多種誘因誘導(dǎo)，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，如TNF、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)和凋亡相關(guān)因子配體(FasL)；活性氧(reactive oxidative species，ROS)[3]：脂多糖和某些病原體和損傷相關(guān)分子模式(damage related molecular model，DAMPs)等。其中由TNF-α/腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)[4]誘導(dǎo)的通路是目前研究最為廣泛和深入的導(dǎo)致壞死性凋亡的通路(圖1)，因此將進(jìn)一步討論該途徑以闡明關(guān)鍵的信號(hào)成分。

圖1 TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡分子機(jī)制

1.2 復(fù)合體1的形成 TNFα與TNFR1結(jié)合后，TNFR1發(fā)生構(gòu)象改變?nèi)刍?，繼而通過(guò)募集多種蛋白質(zhì)來(lái)觸發(fā)復(fù)合體I的快速形成。這些募集的蛋白質(zhì)包括：TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)，受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)，TNFR 相關(guān)因子2(TNFR associated factor2,TRAF2)，TRAF5和E3泛素連接酶細(xì)胞凋亡抑制劑(cIAP1/2)和線(xiàn)性泛素鏈組裝復(fù)合體(LUBAC)。TRADD通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)和初始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)募集到TNFR1上，緊接著RIPK1與TRAF2/5通過(guò)自身DD與TRADD相互作用被招募。然后，TRAF蛋白招募cIAP1/2，后者介導(dǎo)復(fù)合體I成員包括RIPK1的K63泛素化。LUBAC通過(guò)與復(fù)合體I中的K63泛素鏈結(jié)合而被招募，并對(duì)RIPK1進(jìn)行線(xiàn)性(M1)泛素化。去泛素化酶CYLD及其SPATA2與A20和LUBAC一起被募集到復(fù)合體I中[5]。NEMO(NF-κB必需調(diào)節(jié)劑)，也稱(chēng)為IKKγ，與RIPK1的K63多泛素鏈特異性結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致IkB激酶(IKKs)復(fù)合體(IKKα和IKKβ)的后續(xù)募集。此外，RIPK1的多聚泛素化對(duì)于募集轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶(transforming growth factor β activated kinase，TAK)復(fù)合體[TAK1和TAK1結(jié)合蛋白(TAB)1/2]也是必不可少的[6]。

1.3 RIPK1的激活 復(fù)合體I中RIPK1的廣泛翻譯后修飾，包括泛素化、去泛素化和磷酸化，影響著RIPK1的激活，進(jìn)而決定細(xì)胞的生存或死亡以及細(xì)胞如何死亡。

1.3.1 RIPK1的泛素化和去泛素化修飾 在復(fù)合體I中，RIPK1受到多種泛素修飾，包括K63、M1和K48泛素化，這些泛素修飾在調(diào)節(jié)RIPK1的活化方面具有關(guān)鍵作用[7]。 RIPK1的K63泛素化由cIAP1/2催化，繼而介導(dǎo)了LUBAC的招募。LUBAC介導(dǎo)RIPK1的MI泛素化，通過(guò)募集多種含有UBAN的泛素結(jié)合蛋白，包括NF-B必需調(diào)節(jié)劑(NEMO)、NF-κB激活的A20結(jié)合抑制因子1(ABIN1)和optineurin(OPTN)，這些蛋白可以促進(jìn)IKKs的激活、招募A20或調(diào)控RIPK1的K48泛素化，從而抑制RIPK1的激活[8-9]。Annibaldi等[10]發(fā)現(xiàn)CIAP1還介導(dǎo)RIPK1的K48泛素化，抑制其活性，促進(jìn)其降解。

RIPK1上M1/K63泛素化與去泛素化復(fù)合體CYLD/SPATA2的比例對(duì)于調(diào)節(jié)其激活是至關(guān)重要[5,9]。缺乏LUBAC，例如在HOIP缺陷的細(xì)胞中，細(xì)胞對(duì)RIPK1激酶的激活和對(duì)TNFα誘導(dǎo)的死亡高度敏感。另一方面，CYLD主要通過(guò)去除RIPK1上的M1泛素鏈和K63泛素鏈來(lái)促進(jìn)RIPK1的活化，CYLD和SPATA2缺乏部分程度上保護(hù)了細(xì)胞免受TNFα誘導(dǎo)的凋亡和壞死性凋亡的影響[5]。SPATA2的丟失損害了CYLD到復(fù)合體I的招募，并保留了RIPK1的M1泛素鏈，RIPK1的激活受到了阻礙[11]。LUBAC和去泛素化復(fù)合體的同時(shí)募集表明，復(fù)合體I中的成員，如TNFR1和RIPK1，既受泛素化又受去泛素化的調(diào)節(jié)。

1.3.2 RIPK1的磷酸化修飾 RIPK1激活也受TAK1介導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)。有證據(jù)表明TAK1可通過(guò)磷酸化直接抑制RIPK1的激活，也可通過(guò)激活下游激酶，包括MAPK激活的蛋白激酶2(MK2)和IKKs[12-13]間接抑制RIPK1的激活。此外，IKKα/β，也可以介導(dǎo)抑制性磷酸化。IKKα/β在Ser25處RIPK1的磷酸化會(huì)直接抑制RIPK1激酶活性，并阻止復(fù)合體II的組裝[14]。因此，TAK1和IKKα/β通過(guò)促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和抑制RIPK1活化介導(dǎo)重要的促生存反應(yīng)。

1.3.3 一種獨(dú)特的RIPK1激活模式 Geng等[12]報(bào)道了一種獨(dú)特的RIPK1激活模式，它由一種不溶于洗滌劑、高度泛素化、活化的RIPK1物種(iuRIPK1)介導(dǎo)；在RIPK1依賴(lài)的凋亡(RDA)中，iuRIPK1在復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅱ的組裝之間起著關(guān)鍵的中介作用。此外，DD不僅在TNFR1信號(hào)的啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用，而且在復(fù)合體Ⅰ向復(fù)合體Ⅱ的轉(zhuǎn)變過(guò)程中介導(dǎo)RIPK1的二聚化，這對(duì)RIPK1的激活也是不可或缺的。

1.4 RDA和壞死性凋亡 RIPK1的激活代表TNFR1途徑中的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)事件，并指示下游細(xì)胞死亡或存活。在正常條件下，RIPK1由于受到多種泛素化或磷酸化修飾抑制其激活，繼而誘導(dǎo)TAK和IKK復(fù)合體的形成，二者協(xié)同觸發(fā)NF-κB、p38MAPK及其下游效應(yīng)激酶MK2的激活，從而促進(jìn)多種促炎性和促存活基因轉(zhuǎn)錄和翻譯[6]。當(dāng)受到如HOIP缺陷、缺乏LUBAC等各種因素干擾時(shí)，RIPK1被激活，RIPK1的激活可通過(guò)驅(qū)動(dòng)RIPK1-TRADD-Fas相關(guān)DD蛋白(FADD)-caspase-8復(fù)合體(復(fù)合體Ⅱa)的形成觸發(fā)caspase激活并導(dǎo)致RIPK1依賴(lài)的凋亡(RDA)[12]。相反，當(dāng)細(xì)胞在激活凋亡介質(zhì)caspase-8方面有缺陷時(shí)，RIPK1激活通過(guò)形成RIPK1-RIPK3-混合系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)復(fù)合體(復(fù)合體Ⅱb)導(dǎo)致壞死性凋亡。像RIPK1一樣，RIPK3具有N端激酶結(jié)構(gòu)域，其后是包含RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)的中間結(jié)構(gòu)域；RIPK3通過(guò)RHIM被招募到RIPK1上被磷酸化激活。MLKL隨后被磷酸化的RIPK3招募并與RIPK1和RIPK3形成一個(gè)壞死體，在壞死體中RIPK3介導(dǎo)MLKL的磷酸化激活。在結(jié)構(gòu)上，MLKL由一個(gè)N-末端四螺旋束結(jié)構(gòu)域(N-terminal four-helical bundle domain，NTD)、一個(gè)帶有兩個(gè)α-螺旋的支撐區(qū)(brace region，BR)和一個(gè)含有螺旋激活環(huán)和ATP結(jié)合口袋的C-末端激酶樣結(jié)構(gòu)域(kinase like domain，KLD)組成。MLKL的磷酸化導(dǎo)致BR的釋放，形成四聚體和隨后的八聚體而激發(fā)NTD與質(zhì)膜的結(jié)合[15]。即當(dāng)MLKL八聚體從壞死體上解離后，移位到質(zhì)膜上，破壞了膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞壞死性凋亡。

2 壞死性凋亡在腦卒中的研究進(jìn)展

2.1 缺血性腦卒中 缺血是由于組織的血流受阻引起的，繼而因氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致細(xì)胞死亡；血流恢復(fù)后的再灌注可能導(dǎo)致ROS的爆發(fā)，ROS可介導(dǎo)RIPK1自磷酸化，繼而促進(jìn)RIPK3依賴(lài)的壞死性凋亡[3]。

2.1.1 壞死性凋亡與缺血性腦卒中 Degterev等[16]首次發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡參與導(dǎo)致小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦損傷，其機(jī)制不同于細(xì)胞凋亡。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)了一種特異性強(qiáng)的壞死性凋亡小分子抑制劑NEC-1，后來(lái)被證明可抑制壞死性凋亡的關(guān)鍵步驟RIPK1的激活。此后，一系列研究表明壞死性凋亡與缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，針對(duì)壞死性凋亡相關(guān)蛋白的藥物抑制或基因敲除能改善缺血性腦卒中后的腦損傷和神經(jīng)功能。

在模擬缺血性腦卒中條件的缺氧-葡萄糖剝奪(oxygen-glu-cose deprivation，OGD)和MCAO模型中，Yang等[17]發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡的相關(guān)蛋白R(shí)IPK1、RIPK3、MLKL以及缺氧條件下重要的轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-Alpha，HIF-1α)表達(dá)上調(diào)。RIPK3抑制劑GSK‘872、凋亡抑制劑zVAD-fmk與GSK‘872的聯(lián)合處理和RIPK3 siRNA可抑制這些蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞死亡、局灶性腦缺血和神經(jīng)功能缺損，而單獨(dú)使用zVAD-fmk卻做不到。此外，研究還發(fā)現(xiàn)zVAD-fmk與GSK‘872的聯(lián)合處理比單一抑制劑處理效果更好。在Qu等[18]用OGD/zVAD-fmk處理的神經(jīng)元中，RIPK1和RIPK3表達(dá)上調(diào)，并且RIPK1、RIPK3與MLKL的相互作用增加，而siRNA介導(dǎo)的MLKL抑制減輕了神經(jīng)元死亡。在小鼠缺氧/缺血(hypoxic/ischemic,H/I)腦損傷模型中，Nec-1s治療可以減少高血糖小鼠梗死面積，表明在高血糖條件下，壞死性凋亡是導(dǎo)致腦損傷加劇的原因[19]，而且Xuan等[20]也發(fā)現(xiàn)預(yù)防壞死性凋亡可以減輕H/I介導(dǎo)的2型糖尿病小鼠腦損傷。在小鼠腦缺血/再灌注(Ischemia/ Reperfusion，I/R)模型中，Zhou等[21]發(fā)現(xiàn)在12 h后MLKL表達(dá)明顯增加，48 h達(dá)高峰，腹腔注射MLKL抑制劑Necrosulfonamide(NSA)后，腦梗死體積明顯縮小，神經(jīng)功能缺損程度明顯緩解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NSA通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑而不是抑制RNA轉(zhuǎn)錄途徑降低MLKL水平。據(jù)報(bào)道，女貞苷(Ligustroflavone) 可以保護(hù)大鼠大腦免受缺血性損傷，其益處與通過(guò)抑制RIPK3與RIPK1或MLKL的相互作用有關(guān)[22]。

以上這些發(fā)現(xiàn)表明，壞死性凋亡與OGD、MCAO、H/I和I/R所致缺血性腦損傷有關(guān)，并且RIPK1、RIPK3和MLKL是治療壞死性凋亡的潛在靶點(diǎn)，促進(jìn)它們的降解可能是減少缺血性腦損傷的有效途徑。

2.1.2 酸中毒通過(guò)介導(dǎo)壞死性凋亡促進(jìn)缺血性腦卒中的發(fā)生 酸中毒在缺血性腦卒中等神經(jīng)疾病中很常見(jiàn)。傳統(tǒng)上，鈣離子通過(guò)酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a)內(nèi)流被認(rèn)為是缺血性酸中毒的主要原因。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)一種新形式的神經(jīng)元壞死性凋亡，ASIC1a通過(guò)將RIPK1招募到其C端(CT)促使其磷酸化激活來(lái)介導(dǎo)壞死性凋亡，而不依賴(lài)于其離子傳導(dǎo)功能。在MCAO模型小鼠腦區(qū)發(fā)現(xiàn)ASIC1a-RIPK1相互作用和RIPK1磷酸化，ASIC1a缺乏顯著阻止了RIPK1磷酸化和腦損傷，這表明ASIC1a介導(dǎo)的RIPK1激活參與了缺血性神經(jīng)元損傷。最近，Wang等[24]證明了ASIC1a的N端(NT)與其CT相互作用，形成一種自動(dòng)抑制，在靜止條件下阻止RIPK1的招募和激活。具體來(lái)說(shuō)，酸中毒破壞NT末端的谷氨酸殘基，進(jìn)而影響了ASIC1a的NT-CT的相互作用，顯示出這種自抑制作用的破壞是ASIC1a構(gòu)象信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死的基礎(chǔ)。此外，代表遠(yuǎn)端20個(gè)ASIC1a-NT殘基的膜穿透合成肽NT1-20在體外酸中毒模型和在小鼠缺血性卒中模型中都減少了神經(jīng)元損傷，顯示了針對(duì)ASIC1a自身抑制的治療潛力，對(duì)抗酸中毒來(lái)起到神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 出血性卒中 出血性腦卒中，包括腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)和蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高[25-26]。腦出血后的原發(fā)性損傷通常是由于血腫對(duì)周?chē)X組織的機(jī)械性損傷所致。繼原發(fā)性損傷之后的繼發(fā)性損傷，包括炎癥和細(xì)胞死亡，廣泛地參與了出血后的病理過(guò)程[27]。

2.2.1 壞死性凋亡與ICH 有研究通過(guò)使用NEC-1減少細(xì)胞死亡和改善神經(jīng)功能來(lái)抑制壞死性凋亡，從而間接證明在出血性腦卒中后的病理機(jī)制中存在壞死性凋亡[28]。在膠原酶誘導(dǎo)的ICH小鼠模型中，Zhu等[29]通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)RIPK3缺陷的ICH小鼠壞死細(xì)胞較少。在自體血誘導(dǎo)的大鼠腦出血模型中，Shen等[30]采用小干擾RNA(Small interfering RNA，SiRNA)干擾敲除和重組腺病毒轉(zhuǎn)染RIP1過(guò)表達(dá)的方法治療大鼠腦出血模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIP1基因敲除使腦出血后碘化丙錠陽(yáng)性細(xì)胞減少，而RIP1過(guò)表達(dá)使腦出血后腦組織碘化丙錠陽(yáng)性細(xì)胞增加，免疫組化結(jié)果還表明，RIP1和RIP3、RIP1和MLKL、RIP1和caspase-8的相互作用被RIP1敲除顯著抑制，但被RIP1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)；在類(lèi)似模型中，Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)模型大鼠的血腫周?chē)鷧^(qū)域，E3泛素連接酶CHIP的表達(dá)增加，并且AAV/BBB-CHIP治療可改善腦出血后大鼠的腦損傷。Seo等[32]也報(bào)道，CHIP可介導(dǎo)RIPK1和RIPK3的泛素化并導(dǎo)致它們降解，具有CHIP缺陷的細(xì)胞模型顯示RIPK1和RIPK3的表達(dá)水平升高。此外，RIPK3基因敲除可以減輕因CHIP缺陷引起的炎癥和早期死亡。Cai等[33]在ICH模型大鼠腦內(nèi)檢測(cè)到壞死性標(biāo)志物p-MLKL，并發(fā)現(xiàn)交叉電針(cross electro-nape acupuncture，CENA)可通過(guò)阻斷RIPK1和RIPK3之間的相互作用，進(jìn)而抑制RIPK1介導(dǎo)的壞死性凋亡。另外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CENA可降低ICH模型大鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)。

2.2.2 壞死性凋亡與SAH RIPK1/RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡通路也參與了SAH后的病理生理改變。Yuan等[34]采用自體輸血模型，發(fā)現(xiàn)在SAH所致大鼠腦損傷中RIP3表達(dá)增強(qiáng)，24 h達(dá)高峰?；蚧蛩幬镆种芌IP3或TNF-α可減輕SAH所致的腦損傷，而過(guò)表達(dá)RIP3則加重腦損傷。此外Chen等[35]發(fā)現(xiàn)RIPK3選擇性抑制劑GSK‘872降低RIPK3和MLKL的蛋白水平，減少了RIPK3介導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡和隨后的促炎蛋白HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位和表達(dá)，改善了腦水腫和神經(jīng)功能缺損。綜上，壞死性凋亡參與了ICH和SAH所致的腦損傷，并且干擾RIPK1、RIPK3和MLKL及其相互作用是減少出血性腦損傷的有效途徑。

2.3 褪黑素通過(guò)上調(diào)A20的表達(dá)抑制壞死性凋亡 褪黑素被報(bào)道在腦卒中后具有神經(jīng)保護(hù)作用，無(wú)論是缺血性的[36]還是出血性的[37]。Lu等[36]發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)上調(diào)腦出血后去泛素化酶A20的表達(dá)，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞中A20的表達(dá)來(lái)抑制RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡。這些發(fā)現(xiàn)暗示A20可能成為治療腦出血的新的潛在靶點(diǎn)。

3 結(jié)論與展望

壞死性凋亡，又稱(chēng)程序性壞死，是除凋亡之外的一種重要的細(xì)胞程序性死亡類(lèi)型。自壞死性凋亡首次被報(bào)道以來(lái)，只有不到20年時(shí)間，但對(duì)其信號(hào)分子機(jī)制及其與腦卒中疾病相關(guān)性的認(rèn)識(shí)有了很大的提高。壞死性凋亡參與了腦卒中所致的腦損傷，RIPK1和RIPK3以及MLKL是壞死性凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，針對(duì)壞死性凋亡相關(guān)蛋白的抑制治療已被證實(shí)在不同動(dòng)物模型和不同細(xì)胞類(lèi)型中具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而目前除rtPA外，很少有藥理藥物在臨床上被證明是有效的，正如許多藥物所顯示的那樣，臨床前研究取得良好的效果，但在臨床實(shí)踐中觀(guān)察到的效果較差。因此，未來(lái)需要更多類(lèi)似于壞死性凋亡抑制劑或基因修飾等研究來(lái)探討壞死性凋亡在腦卒中臨床上的作用。此外，腦卒中疾病病理過(guò)程中多種死亡機(jī)制同時(shí)發(fā)生[38-39]，并且與炎癥機(jī)制[30]有著密不可分的聯(lián)系，一些研究者通過(guò)聯(lián)合使用針對(duì)不同損傷機(jī)制的抑制劑也取得了比單一抑制劑更好的治療效果[30,40]，因此未來(lái)尋找這些信號(hào)通路的共同效應(yīng)因子顯得十分必要。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。