任釗江，王玉琴，王宏生，宋梅玲

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院)，青海 西寧 810016)

種子萌發(fā)是種子植物生活史中實(shí)現(xiàn)種群更新和物種延續(xù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[1]。植物種子發(fā)芽能力是其價(jià)值的重要體現(xiàn)。種子萌發(fā)期和幼苗建植期易受外界環(huán)境的影響，導(dǎo)致其死亡率較高[2]。種子能否成功發(fā)芽并定植是其種群更新的重要因素[3]。植物種子發(fā)芽能力受多種環(huán)境因素的影響，其中溫度是影響發(fā)芽能力的重要因素，由于溫度影響種子內(nèi)部各種酶的活性，進(jìn)而影響種子內(nèi)部物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及種子和外界的物質(zhì)交換，溫度過高或過低都不利于種子萌發(fā)[4]。種子萌發(fā)及萌發(fā)后的生長狀況受溫度條件的影響，其萌發(fā)所需的最適溫度往往與其起源地生態(tài)條件和所處的生存環(huán)境有關(guān)[5]。因此，研究溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響對(duì)于明確其在特定生長環(huán)境中的發(fā)芽和生長機(jī)制具有重要意義。

盡管種子可在較大的溫度范圍內(nèi)完成萌發(fā)過程，但低溫處理后，種子的休眠狀態(tài)和發(fā)芽特征等卻有顯著差異[6]。種子休眠是指在預(yù)定的時(shí)間范圍內(nèi)本該有生命活力體征的種子，在預(yù)計(jì)正常、利于種子萌發(fā)的一些環(huán)境因子的組合條件下，不能按期正常萌發(fā)的一種生物現(xiàn)象[7]。休眠是植物的一種生存策略，不但可以為種子的傳播以及擴(kuò)散爭(zhēng)取時(shí)間，還能促使種子在合適環(huán)境條件下萌發(fā)，可以有效地調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的時(shí)空分布[8]。種子休眠對(duì)于植物而言是有利的生態(tài)適應(yīng)特征，但卻成為人工育種的主要障礙，需要較長時(shí)間或者復(fù)雜的催芽方法才可令種子萌發(fā)，給草業(yè)生產(chǎn)造成一定程度的困難[9]。因此，尋找有效打破種子休眠的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。解除種子休眠的方法有多種：用物理方法去除種皮的硬實(shí)性，減少種皮對(duì)發(fā)芽的障礙，提高種子發(fā)芽率；化學(xué)物質(zhì)和激素刺激種子發(fā)芽；清水漂洗和光照處理解除休眠；低溫層積加快種子后熟，促進(jìn)種子發(fā)芽等[8-9]。有研究報(bào)道，適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理能夠打破種子休眠，提高萌發(fā)率[6]。運(yùn)用低溫預(yù)處理的方法，研究種子發(fā)芽率和幼苗生長的變化，有利于探究和揭示植物種子的萌發(fā)機(jī)制。

青藏高原高寒草甸是我國高山草原的典型代表，具有溫度低、相對(duì)濕度高、生長季節(jié)短等特征[10]。黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)是菊科、橐吾屬多年生灰綠色草本植物，是一種對(duì)高寒草甸有著嚴(yán)重危害的毒害草，是高寒草地退化的標(biāo)志性有毒植物之一[11]，在青藏高原有著極強(qiáng)的入侵能力，對(duì)草地生產(chǎn)力和畜牧業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響[12]。黃帚橐吾體內(nèi)可以產(chǎn)生特殊揮發(fā)物質(zhì)，如萜類物質(zhì)，抑制草原上其他植物種子的萌發(fā)及生長，使原本正常的草原退化，且其無性繁殖能力強(qiáng)大，如根莖繁殖，最終形成黃帚橐吾的單優(yōu)勢(shì)種群[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃帚橐吾種子在較大的溫度范圍內(nèi)均可萌發(fā)，且光照、種子大小等均會(huì)對(duì)黃帚橐吾種子的萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生不同程度的影響[13-14]，也有研究發(fā)現(xiàn)黃帚橐吾種子的萌發(fā)率不高[4,13]，具體原因可能是種子休眠難以被打破，也可能是種子萌發(fā)期間對(duì)外界環(huán)境條件過于敏感[15]。本研究以黃帚橐吾種子為對(duì)象，通過模擬高寒環(huán)境低溫或超低溫的條件，觀察黃帚橐吾種子萌發(fā)率、萌發(fā)速度和萌發(fā)后幼苗生長的變化，研究不同低溫預(yù)處理對(duì)黃帚橐吾種子萌發(fā)的影響，以期為毒害草型退化草地治理以及黃帚橐吾的有效防除提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 種子來源

供試種子來自于青海省海北藏族自治州海晏縣青海湖鄉(xiāng)達(dá)玉德吉村(N 37°4′1″，E 100°52′48″)，海拔3 230 m，氣候?qū)俑咴箨懶詺夂?，年均氣?.2～3.4 ℃，年均降水量277.8～499.5 mm，降水多集中在5-9月，年均日照2 580～2 750 h。草地類型以草甸化草原為主，以線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)、矮嵩草(K.humilis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)為主要建群種，伴生種為高原早熟禾(Poaalpigena)、中華羊茅(Festucasinensis)、扁蓿豆(Melissitusruthenica)等，牧草生長期4-5個(gè)月，土壤以高山草甸土為主。種子采集時(shí)間為2018年9月底和2019年9月底，兩次均于同一地點(diǎn)采集，采集區(qū)域面積為1.0 hm2，隨機(jī)采集種子，將黃帚橐吾花序剪下裝入樣袋，置于實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干后手動(dòng)將種子脫落，室溫下儲(chǔ)藏，溫度約為20 ℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020年1月初進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)，觀察不同溫度預(yù)處理后黃帚橐吾種子萌發(fā)能力的變化。

本試驗(yàn)設(shè)置了2個(gè)溫度預(yù)處理，分別為-20 ℃和4 ℃，-20 ℃下的種子處理時(shí)間分別為0.5、1和2 h，4 ℃下的種子處理時(shí)間分別為24、48和72 h。使用TP法進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)內(nèi)放置2層干燥濾紙，用裝有蒸餾水的注射器潤濕濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿放置50粒種子。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。置于光照培養(yǎng)箱中，變溫15～25 ℃(10 h/14 h)條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3 000 lx。試驗(yàn)期間始終保持濾紙濕潤，并且每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，試驗(yàn)時(shí)間為17 d。最后，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)隨機(jī)選取5株幼苗，測(cè)定并記錄根長(胚根延伸長度)和苗長(胚芽延伸長度)，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率。

發(fā)芽指數(shù)：GI=∑(Gt/Dt)

式中，Gt為在時(shí)間t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[16]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel計(jì)算并作圖，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相同年份，不同處理之間的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、根長和苗長的差異顯著性采用單因素方差分析方法進(jìn)行檢驗(yàn)。不同年份，相同處理之間的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、根長和苗長的差異顯著性采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，顯著性區(qū)間定義為95%水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 ℃預(yù)處理對(duì)黃帚橐吾種子發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)的影響

2018年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24、48和72 h后發(fā)芽率與對(duì)照相比均有所提高(圖1)，其中，24 h處理下達(dá)到顯著水平(P<0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24和48 h后，其發(fā)芽率顯著高于對(duì)照，處理72 h后種子發(fā)芽率與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子發(fā)芽率在各處理時(shí)間下均顯著高于2018年采集的種子(P<0.05)。

圖1 4 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子發(fā)芽率Fig.1 Germination rate of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃注：*表示不同年份之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示2018年種子在不同處理時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示2019年種子在不同處理時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。下同

采于2018年的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24 h和48 h后，其發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照之間差異不顯著(P>0.05)，而處理72 h后發(fā)芽指數(shù)顯著低于對(duì)照(P<0.05)(圖2)。2019年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)4 ℃處理24 h后與對(duì)照差異不顯著，處理48、72 h后，發(fā)芽指數(shù)顯著低于對(duì)照(P<0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子發(fā)芽指數(shù)高于2018年采集的種子，而經(jīng)過4 ℃預(yù)處理后2個(gè)年份之間差異不顯著(圖2)。

圖2 4 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子發(fā)芽指數(shù)Fig.2 Germination index of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2.2 4 ℃預(yù)處理對(duì)黃帚橐吾種子根長與苗長的影響

采于2018、2019年的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24 h后，其幼苗根長與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)，而處理48 h和72 h后，其根長顯著低于對(duì)照(P<0.05)(圖3)。2019年采集的黃帚橐吾種子根長在各處理時(shí)間下均顯著高于2018年采集的種子(P<0.05)。

圖3 4 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子根長Fig.3 Root length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2018年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24、48 h后，種子苗長相比于對(duì)照沒有顯著差異(P>0.05)，處理72 h后，其苗長顯著低于對(duì)照(P<0.05)(圖4)。采于2019年的黃帚橐吾種子經(jīng)過4 ℃預(yù)處理24、48和72 h與對(duì)照相比均顯著降低(P<0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子苗長顯著高于2018年，經(jīng)過4 ℃預(yù)處理后2個(gè)年份間無顯著差異(圖4)。

圖4 4 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子苗長Fig.4 Seedling length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2.3 -20 ℃預(yù)處理對(duì)黃帚橐吾種子發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)的影響

2018年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理0.5、1和2 h 后發(fā)芽率與對(duì)照相比無顯著變化(P>0.05)。而2019年采集的種子經(jīng)過-20 ℃處理0.5、1和2 h后發(fā)芽率均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子發(fā)芽率在各處理下均顯著高于2018年采集的種子(圖5)。

圖5 -20 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子發(fā)芽率Fig.5 Germination rate of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

2018年與2019年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理0.5 、1和2 h后發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照相比均無顯著差異(P>0.05)。2019年采集的黃帚橐吾種子發(fā)芽指數(shù)高于2018年采集的種子(P<0.05)，而經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理后，二者之間無顯著差異(圖6)。

圖6 -20 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子發(fā)芽指數(shù)Fig.6 Germination index of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

2.4 -20 ℃預(yù)處理對(duì)黃帚橐吾種子根長與苗長的影響

采于2018年和2019年的黃帚橐吾種子經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理0.5、1和2 h后幼苗的根長與對(duì)照相比均無顯著變化(P>0.05)。在各處理下，2019年采集的黃帚橐吾根長均顯著高于2018年采集的種子(P<0.05)(圖7)。

2018年采集的黃帚橐吾種子經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理0.5 h后種子苗長與對(duì)照相比顯著提高(P<0.05)(圖8)，處理1 h和2 h后相比于對(duì)照沒有顯著差異。2019年黃帚橐吾種子經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理0.5 h和1 h后相比于對(duì)照沒有顯著差異(P>0.05)，處理2 h后相比對(duì)照顯著降低。2019年采集的黃帚橐吾的苗長顯著高于2018年(P<0.05)，但是經(jīng)過-20 ℃預(yù)處理后，2個(gè)年份之間差異不顯著(圖8)。

圖7 -20 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子根長Fig.7 Root length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

圖8 -20 ℃預(yù)處理下黃帚橐吾種子苗長Fig.8 Seedling length of Ligulariavirgaurea seeds pretreated at -20 ℃

3 討論

溫度過低，會(huì)抑制種子內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)和代謝，從而影響酶的活性，最終抑制種子的正常代謝和發(fā)芽[17-18]、延長種子萌發(fā)時(shí)間[19]，但低溫也可打破種子的熱休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[20]。在不同情況下，低溫對(duì)種子發(fā)芽造成的影響也不同。本研究中黃帚橐吾種子的發(fā)芽率普遍不高，與之前的研究結(jié)果一致[4,21]，這或許與黃帚橐吾種子自身的保護(hù)機(jī)制有關(guān)系[22]。也有研究結(jié)果證明，在生境不適宜種子萌發(fā)時(shí)，黃帚橐吾種子可能存在選擇性休眠，一部分隨著擴(kuò)散媒介散播到其他生境中，而沒有擴(kuò)散的種子當(dāng)環(huán)境一旦適宜時(shí)就會(huì)萌發(fā)[14]。溫度的變化能促進(jìn)種子胚的發(fā)育，進(jìn)而提高種子的萌發(fā)率[23]。本研究中無論是4 ℃預(yù)處理還是-20 ℃預(yù)處理均提高了黃帚橐吾種子的發(fā)芽率，這可能是由于低溫預(yù)處理增加了黃帚橐吾種子的活力或促進(jìn)了種子胚的發(fā)育，進(jìn)而提高其發(fā)芽率，這是黃帚橐吾種子長期在高寒環(huán)境下生存而產(chǎn)生的適應(yīng)性機(jī)制。另一方面，采于2019年的黃帚橐吾種子的發(fā)芽率普遍高于采自2018年的種子，有研究表明，黃帚橐吾種子儲(chǔ)存時(shí)間越長，萌發(fā)率越低[14]，本研究與之一致。另外，2018年生長季降水量低于2019年，因此，同一時(shí)間采集的種子，2個(gè)年份之間的成熟度存在差異，這也是不同年份間黃帚橐吾種子發(fā)芽率有差異的原因之一。

發(fā)芽指數(shù)是發(fā)芽率指標(biāo)的細(xì)化和深化，它放大了種子活力的特征[24]。本研究中，隨著4 ℃預(yù)處理時(shí)間的延長，黃帚橐吾種子的發(fā)芽指數(shù)逐漸降低，雖然短時(shí)間的低溫刺激會(huì)使種子煥發(fā)出活力，然而長時(shí)間的低溫預(yù)處理則使發(fā)芽的周期延長，但黃帚橐吾的種子仍然具有活力并最終萌發(fā)，這為其在多變的環(huán)境條件下的生存和擴(kuò)張?zhí)峁┝吮Ｕ蟍14]。前人的研究也發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)延長種子的萌發(fā)持續(xù)時(shí)間[14,19]，這是黃帚橐吾種子長期適應(yīng)高寒環(huán)境形成的機(jī)制，通過延長種子的萌發(fā)周期確保在草地中占據(jù)更大的生存空間。對(duì)于不同年份采集的種子，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照條件下2019年的黃帚橐吾種子的發(fā)芽指數(shù)高于2018年，而經(jīng)過4 ℃與-20 ℃預(yù)處理后，兩個(gè)年份之間差異不顯著，表明黃帚橐吾種子儲(chǔ)存時(shí)間越長，種子的萌發(fā)活力可能越低，與之前的研究結(jié)果一致[14]。但是，低溫預(yù)處理對(duì)于長時(shí)間儲(chǔ)存的黃帚橐吾種子，起到了提高其萌發(fā)活力的作用，進(jìn)而在萌發(fā)速度上減少了與新鮮種子之間的差距。

在植物一生中，種子萌發(fā)后的生長情況對(duì)植物后期的建植至關(guān)重要[13]，種子萌發(fā)后其根長和苗長隨著外界環(huán)境脅迫強(qiáng)度的增加而降低[25]。之前的研究結(jié)果表明，植物種子的萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育會(huì)因浸種初始溫度的不同而不同[26]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4 ℃低溫處理后，隨著處理時(shí)間的延長，黃帚橐吾種子萌發(fā)后其根長和苗長均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而-20 ℃處理后，黃帚橐吾幼苗的根長和苗長與對(duì)照相比差異不大，甚至高于對(duì)照，這是由于黃帚橐吾種子連續(xù)處于低溫環(huán)境下(24、48或72 h)，其萌發(fā)和生長活力受到了影響，種子根長和苗長隨著外界環(huán)境脅迫強(qiáng)度的增加而降低[13]，而-20 ℃處理雖然溫度達(dá)到極低狀態(tài)，但處理時(shí)間不長(0.5、1或2 h)，與其高寒的生存環(huán)境相近，一旦條件適宜，黃帚橐吾種子的發(fā)芽和生長還可能受到一定的促進(jìn)。這與黃帚橐吾長期在高寒環(huán)境下生存形成的生存機(jī)制有關(guān)。值得注意的是，2019年采集的種子在-20 ℃預(yù)處理后，其苗長有所降低，這可能主要由于新采集的種子還未經(jīng)過足夠時(shí)間的后熟等過程，應(yīng)對(duì)外界環(huán)境突然變化的能力仍未發(fā)育完全，不能為幼苗的生長提供足夠的養(yǎng)分。因此，黃帚橐吾種子的萌發(fā)與生境的氣候、土壤、生長年份等均有密切聯(lián)系，具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，低溫預(yù)處理可以提高黃帚橐吾種子的發(fā)芽率；短期的低溫處理對(duì)于黃帚橐吾幼苗的生長有促進(jìn)作用，對(duì)發(fā)芽指數(shù)影響不大；而低溫處理時(shí)間過長，則會(huì)對(duì)種子的發(fā)芽指數(shù)和幼苗的生長產(chǎn)生不利的影響；存儲(chǔ)時(shí)間越長，黃帚橐吾種子的萌發(fā)活力越低，但是，一定的低溫預(yù)處理能減緩存儲(chǔ)時(shí)間造成的影響。這對(duì)于黃帚橐吾種群在高寒草地群落中的長期生存和擴(kuò)張可能發(fā)揮了有利作用。