郭濤，王榮靖，宋藝君，葉建，焦慧，于代杰，常暉

(1.空軍第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

黃精為百合科植物黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)的干燥根莖[1]，始載于《名醫(yī)別錄》，被列為上品。生黃精味甘性平，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效。生黃精具麻味，刺人咽喉。蒸后補脾、潤肺、益腎的功能增強，并可除去麻味，以免刺激咽喉。用于脾胃虛弱，肺虛燥咳，腎虛精虧。如治腎虛精虧、頭暈足軟的枸杞丸[1]。酒黃精能助其藥勢，使其滋而不膩，更好地發(fā)揮補益作用。如用于治療氣血兩虧的九轉(zhuǎn)黃精丹及用于腎虛陽痿，夢遺滑精的海馬保腎丸[1]。黃精主要含多糖、皂苷、生物堿、木脂素、黃酮、植物甾醇以及揮發(fā)油等成分[2-3]，具有抗氧化抗衰老、抑制老年癡呆和改善學習記憶、降血糖、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-5]。近年來，黃精生品對咽喉的刺激性受到人們的重視，研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，黃精炮制品與生品在化學特征、藥效、刺激性方面均存在較大差異。

九蒸九曬又稱九蒸九曝[9-10]，是古代常用的一種傳統(tǒng)炮制方法。該法起源于南朝《雷公炮炙論》中的“單蒸法”，到唐《千金翼方》的“雙蒸法”，在不同特性藥物應用之后，“九蒸九曬”炮制法逐步形成。黃精是“四大九蒸貨”之一。唐代，《食療本草》首次提出九蒸九曬炮制黃精，記載：“取甕子去底，釜上安置令得，所盛黃精令滿；密蓋，蒸之。令氣溜，即曝之。第二遍蒸之亦如此，九蒸九曝”。宋代，《日華子諸家本草》云：“黃精單服，九蒸九曝，食之駐顏斷谷”。明代，《本草原始》云：“黃精去須，九蒸九曬用，每蒸一次，必半日方透”。清代，《青陽縣志》云：“以天然黃精為原料，經(jīng)過九蒸九曬，成品內(nèi)赤外黃，味香甜”。傳統(tǒng)認為，九蒸九曬后的黃精，一方面藥性發(fā)生改變，有效成分累積，可增強其補脾潤肺、溫補腎陽的作用；另一方面可消除生黃精的刺激性，認為[11]生黃精含有的黏液質(zhì)會刺激咽喉，通過反復蒸曬，黏液質(zhì)被分解，從而消除生黃精的刺激性，達到減毒的目的。

隨著現(xiàn)代飲片行業(yè)大生產(chǎn)的發(fā)展，黃精炮制工藝逐步簡化，現(xiàn)在多采用一蒸一曬法。在《中國藥典》2020年版，采用酒蒸或酒燉的炮制方法，與傳統(tǒng)的九蒸九曬炮制方法差異很大[12-14]。本文基于黃精“九蒸九曬”的傳統(tǒng)炮制方法，以黃精中多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛(5-HMF)和浸出物含量為評價指標，對其炮制過程中主要化學成分的動態(tài)變化規(guī)律進行分析，意欲深入探究黃精九蒸九曬的炮制機制，以揭示黃精炮制過程內(nèi)在質(zhì)量變化規(guī)律和最佳炮制方法，進一步闡明黃精現(xiàn)代炮制方法簡化的合理性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SP-1920型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫有限公司)；MS105型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥 黃精藥材購自陜西漢中黃精基地，經(jīng)陜中醫(yī)藥學院胡本祥教授鑒定為百合科植物黃精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根莖。葡萄糖對照品(批號：110833-201707，純度：99.9%)、5-HMF對照品(批號：111626-201711，純度：99.2%)、薯蕷皂苷對照品(批號：112809-201904，純度：99.9%)均購于中國食品藥品檢定研究院；黃酒(紹興黃酒釀造有限公司，批號：20191202)；甲醇采用色譜純，水采用純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃精不同炮制程度樣品的制備 清蒸-九蒸九曬制黃精[12,15]：取生黃精，蒸鍋蒸制6 h，熄火悶潤一夜(8 h)，次日取出置60 ℃烘箱至外皮微干，為蒸曬一次的制黃精，反復9次蒸曬，分別得到蒸曬不同次數(shù)的制黃精。切制，干燥，依次記為M1～M9。

酒蒸-九蒸九曬制黃精[12,15]：取生黃精，加黃酒拌勻(黃酒和藥材的配比為20∶100)，待黃酒吸收后，按清蒸-九蒸九曬制黃精的制法操作得到樣品，依次記為MC1～MC9。第一次蒸制黃酒用量為黃酒總量的20%，以后每次蒸制黃酒用量為黃酒總量的10%。

2.2 多糖定量測定[16]

2.2.1 對照品溶液的制備 取葡萄糖對照品24 mg，精密稱定，置量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.48 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細粉0.25 g，精密稱定，放置圓底燒瓶中，將80%乙醇150 mL加入，置水浴中加熱回流1 h，濾過，將剩余殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，然后將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，將殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，合并濾液與洗液，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

2.2.3 最大吸收波長的確定 取“2.2.1”“2.2.2”項下對照品溶液200 μL、供試品溶液2 mL，按“2.2.4”項下方法顯色，以相應試劑為空白，分別將上述對照品和供試品溶液在分光光度計全波長掃描，結(jié)果對照品和供試品均在583 nm處出現(xiàn)最大吸收。故選擇波長583 nm進行檢測。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取500、400、300、200、100、50 μL對照品溶液，分別置10 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL，搖勻，冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，搖勻，放冷后98 ℃水浴保溫10 min，取出，置0 ℃冰水浴冷卻10 min，取出，以相應試劑為空白，按照可見分光光度法(通則0401)，在583 nm波長處依法測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=7.745 4X+0.003 2，r=0.999 9。試驗結(jié)果表明，葡萄糖在2.4～24.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取同一供試品溶液(M1)，精密吸取2 mL，按“2.2.4”項下條件測定吸光度，重復測定6次，結(jié)果RSD為0.61%，表明本方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(M1)，精密吸取2 mL，按“2.2.4”項下測定方法，分別在樣品制備好后0、10、20、30、40 min測定吸光度，得到RSD為0.79%，表明供試品溶液在40 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一樣品(M2)6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每份供試品溶液精密吸取1 mL，按照2.2.4項下方法測定吸光度，得到RSD為3.11%，表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知多糖含量的樣品9份，每份0.125 g，按照樣品多糖含量的120%、100%、80%依次加入葡萄糖對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并測定吸光度，得到平均回收率為98.42%，RSD為1.14%，結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.2.9 樣品測定 取“2.2.2”項下制備的M1～M9及MC1～MC9供試品溶液，依法進行測定，結(jié)果見表1，多糖含量變化趨勢見圖1。

表1 黃精中各類成分隨蒸曬次數(shù)的動態(tài)變化情況(n=3)

圖1 黃精九蒸九曬過程中多糖的含量變化趨勢

由表1、圖1可以看出，經(jīng)過9次蒸曬后，總體來說黃精飲片中多糖含量下降，對于清蒸-九蒸九曬黃精和酒蒸-九蒸九曬黃精減量分別達到23.8%和20.5%；伴隨黃精蒸曬次數(shù)的增加，對于清蒸-九蒸九曬黃精和酒蒸-九蒸九曬黃精，其多糖含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；清蒸-九蒸九曬黃精多糖含量先呈逐漸增大趨勢，第四次蒸曬后多糖含量達到最大值，其后五蒸含量降低，而且清蒸和酒蒸兩組含量變化一致，兩者在第九次蒸曬后多糖含量仍符合藥典要求。

2.3 總皂苷定量測定[17]

2.3.1 對照品溶液的制備 取薯蕷皂苷對照品3.75 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.375 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取黃精粉末1 g，加15倍量80%乙醇，超聲30 min(2次)，過濾，合并濾液至50 mL容量瓶，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.3.3 最大吸收波長的確定 取“2.3.1”“2.3.2”項下所得樣品溶液30 μL、對照品溶液200 μL，水浴蒸干，按“2.3.4”項下方法顯色，以相應試劑為對照，分別將上述樣品和對照品溶液在分光光度計全波長掃描，結(jié)果樣品和對照品均在485 nm有最大吸收。故選擇檢測波長485 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液500、400、300、200、100、50 μL，置具塞刻度試管中，水浴揮干，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，然后冰浴5 min，取出，加5 mL冰醋酸，以相應試劑為空白對照，于485 nm處測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，薯蕷皂苷質(zhì)量濃度(X)為橫坐標作標準曲線，得回歸方程Y=5.678 6X+0.004 7，r=0.999 9，試驗結(jié)果表明，總皂苷在3.13～31.25 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 取對照品溶液，按照“2.3.4”項下條件測定吸光度，重復測定6次，結(jié)果RSD為0.52%，試驗結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液M1，精密吸取200 μL，按“2.3.4”項下方法，分別在樣品制備好后0、10、20、30、40 min測定吸光度，得到RSD為0.68%，表明供試品溶液在40 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 取同一樣品(M2)6份(每份1 g)，按照2.3.2項下方法制備供試品溶液，每份精密吸取200 μL，按照“2.3.4”項下條件測定吸光度，得到RSD為2.08%，表明本方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取平行樣品9份(已知總皂苷含量)，每份0.5 g，按照樣品總皂苷含量的80%、100%、120%依次加入薯蕷皂苷對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，按照“2.3.2”項下方法制備供試品并測定吸光度，得到平均回收率為97.92%，RSD為1.14%，結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.3.9 樣品定量測定 取“2.3.2”項下制備的M1～M9及MC1～MC9供試品溶液，依法進行測定，結(jié)果見表1，總皂苷含量變化趨勢見圖2。

圖2 黃精九蒸九曬過程中總皂苷的含量變化趨勢

從圖2和表1可以看出，隨著黃精蒸曬次數(shù)的增加，總皂苷含量呈緩慢下降趨勢，第九次炮制品與第一次炮制品比較，清蒸-九蒸九曬黃精和酒蒸-九蒸九曬黃精減量分別達到37.0%和38.9%；從一蒸一曬到四蒸四曬，酒蒸黃精的總皂苷含量均高于清蒸黃精，而從五蒸五曬到九蒸九曬，清蒸黃精總皂苷含量均高于酒蒸黃精。

2.4 5-HMF定量測定[18]

2.4.1 色譜條件 Hypurity C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流動相水-甲醇(92∶8)，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：280 nm，進樣量：10 μL。5-HMF對照品和樣品的HPLC圖譜見圖3。

A.對照品；B.樣品 1.5-HMF圖3 5-HMF色譜圖

2.4.2 對照品溶液的制備 取5-HMF對照品，精密稱定，加甲醇溶解得到100 μg·mL-1的對照品溶液。取上述5-HMF對照品1 mL，用甲醇稀釋定容至5 mL容量瓶，得到20 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取樣品0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，水浴加熱回流1 h，放冷，二次稱重，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶液(“2.4.2”項下)，依次取80、40、20、10、5、2 μL進樣，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線，得到方程Y=7×106X-47 497，r=0.999 8，結(jié)果表明5-HMF在0.04～1.6 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗 吸取對照品5-HMF溶液10 μL，按“2.4.1”項下方法連續(xù)進樣6次，得到5-HMF峰面積的RSD為0.72%，表明本方法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.3”項下方法制備M1供試品溶液，分別在樣品制備好后0、4、8、12、24 h依法測定，結(jié)果得到5-HMF峰面積的RSD為0.78%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復性試驗 取M2樣品6份(每份0.2 g)，按照“2.4.3”項下條件制備供試品溶液，依法測定峰面積，得到5-HMF峰面積的RSD為1.22%，表明本方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知5-HMF含量的樣品9份(每份0.1 g)，按照5-HMF含量的120%、100%、80%，分別加入一定量的對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，按“2.4.3”項下條件制備供試品溶液，測定峰面積，得到平均回收率97.82%，RSD為1.31%，結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.4.9 樣品定量測定 取“2.4.3”項下制備的M1～M9及MC1～MC9供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表1，5-HMF含量變化趨勢見圖4。

圖4 黃精九蒸九曬過程中5-HMF的含量變化趨勢

由表1、圖4可以看出，經(jīng)過九次蒸曬后，總體來說黃精飲片中5-HMF含量上升，對于清蒸-九蒸九曬黃精和酒蒸-九蒸九曬黃精增量分別達到5倍多和8倍；伴隨黃精蒸曬次數(shù)的增加，對于清蒸-九蒸九曬黃精和酒蒸-九蒸九曬黃精，其5-HMF含量先呈逐漸增大趨勢，六蒸六曬后5-HMF含量達到最大值，最后三蒸含量降低，至第九次蒸曬后5-HMF含量分別為0.49%和0.48%。

2.5 浸出物定量測定[16]按照《中國藥典》2020年版(四部)2201項下(浸出物測定的熱浸法)依法測定醇溶性浸出物。測定結(jié)果見表1，浸出物含量變化趨勢見圖5。

圖5 黃精九蒸九曬過程中浸出物的含量變化趨勢

由表1、圖5可以看出，伴隨黃精蒸曬次數(shù)的增加，其浸出物的含量變化無明顯規(guī)律，且大致保持在一定范圍內(nèi)。此外，黃精每蒸曬一次制得的炮制品均可達到《中國藥典》2020年版要求。

3 討論

本文較系統(tǒng)分析了黃精清蒸和酒蒸品從一蒸一曬到九蒸九曬成品炮制全過程，測定不同炮制程度制黃精中多糖、總皂苷、5-HMF和浸出物的含量，從而評價黃精九蒸九曬的炮制終點。結(jié)果表明黃精在六蒸六曬后已達到傳統(tǒng)外觀質(zhì)量要求，也符合現(xiàn)行版《中國藥典》性狀要求，黃精中這幾類成分在六蒸六曬時達到拐點，后逐漸趨于穩(wěn)定。六蒸六曬品與一蒸一曬品相比，多糖含量升高，5-HMF含量最高，總皂苷含量降低，浸出物含量基本不變。因此從多糖、5-HMF和總皂苷含量的角度上，六蒸六曬品既是黃精炮制過程中的拐點，又是九蒸九曬的終點，但其藥理作用和臨床功效是否與九蒸九曬黃精、生品黃精存在差異，有待進一步深入研究。

黃精九蒸九曬品的炮制要反復蒸制，以“亮如油，色如漆，甘如飴”為傳統(tǒng)經(jīng)驗指標[10]。九蒸九曬炮制方法雖然會導致多糖含量降低，但卻是黃精的傳統(tǒng)經(jīng)典炮制方法，而《中國藥典》2020年版僅規(guī)定以多糖作為其含量限度指標，其方法專屬性差，難以反映黃精的真實質(zhì)量[19]。因此，在黃精九蒸九曬炮制過程中，如何控制蒸制時間、次數(shù)等，是優(yōu)先把握蒸制時間的長短還是優(yōu)先把握蒸制次數(shù)，并結(jié)合黃精炮制過程中其他成分的變化，來制定其質(zhì)量控制標準，需要進行進一步深入研究。