任天航，周正園，聶紫璇，王君月，廉婧，劉蓬蓬，史輯

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制原理解析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，夏初花開放前采收，干燥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，可用于癰腫疔瘡、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等癥的治療[1]。金銀花主要分布于我國(guó)山東、河南等地，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝等藥效作用，其主要含有的化學(xué)成分包括黃酮類、皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油等[2-3]。而有關(guān)金銀花中核苷類成分的研究近年來(lái)報(bào)道較少，核苷類成分是維持生命活動(dòng)的重要活性物質(zhì)，經(jīng)藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，具有抗病毒、抗腫瘤、抗血小板聚集等多種功效[4-6]。王芳等[7]首次從金銀花中分離鳥苷、5-甲氧基尿嘧啶等核苷類成分，此后有關(guān)金銀花核苷類成分報(bào)道較少，故本研究將采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QQQ-MS/MS)技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定金銀花飲片水提液中核苷類成分含量的方法，并比較研究不同道地產(chǎn)地金銀花飲片水提液中核苷類成分含量的差異，為金銀花飲片的生產(chǎn)加工和提高質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY H-CLASS型UPLC儀(包括二極管陣列檢測(cè)器、二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，數(shù)據(jù)采集與處理采用MassLnx 軟件)和XEVO TQD型MS儀均購(gòu)自美國(guó)Waters公司；Mettler AE240型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士Mettler公司)；DHF-200型手提式高速萬(wàn)能打粉機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥 金銀花飲片5批購(gòu)自河南、河北、山東、安徽等地；對(duì)照品尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷(成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DSTDN009201、DST201009-046、DST201025-195、DST201103-093、DSTDN003401、DST200922-143、DSTDJ010901、DST201029-029、DST201029-029，純度均不低于98%)；乙腈、甲酸為質(zhì)譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件[8-9]

2.1.1 色譜條件 Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)- 0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～3 min，20%B → 25%B；3～5 min，25%B → 45%B；5～6 min，45%B → 60%B；6～6.5 min，60%B → 20%B；6.5～10 min，20%B)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：3 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式。毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣N2，脫溶劑氣流量1 000 L·h-1；脫溶劑溫度：500 ℃。9種核苷成在MRM 模式下的色譜保留時(shí)間和具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～9，MRM離子色譜圖見(jiàn)圖10～18。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)

圖1 尿嘧啶質(zhì)譜圖

圖2 鳥嘌呤質(zhì)譜圖

圖3 黃嘌呤質(zhì)譜圖

圖4 β-胸苷質(zhì)譜圖

圖5 尿苷質(zhì)譜圖

圖6 2′-脫氧腺苷質(zhì)譜圖

圖7 2′-脫氧鳥苷質(zhì)譜圖

圖8 肌苷質(zhì)譜圖

圖9 鳥苷質(zhì)譜圖

圖10 尿嘧啶MRM離子色譜圖

圖11 鳥嘌呤MRM離子色譜圖

圖12 黃嘌呤MRM離子色譜圖

圖13 β-胸苷MRM離子色譜圖

圖14 尿苷MRM離子色譜圖

圖15 2′-脫氧腺苷MRM離子色譜圖

圖16 2′-脫氧鳥苷MRM離子色譜圖

圖17 肌苷MRM離子色譜圖

圖18 鳥苷MRM離子色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷的對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，鳥嘌呤加入0.1mol·L-1鹽酸溶液，黃嘌呤加入0.1%氫氧化鉀溶液，其他對(duì)照品加入超純水溶解，室溫定容，均配制成單一對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 樣品溶液的制備 取樣品0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入超純水20 mL，稱量，密封冷藏過(guò)夜，超聲提取(250 W，40 kHz)60 min，放冷至室溫，用超純水補(bǔ)足減失的量，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液，置于冰箱4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹10-11]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，逐級(jí)稀釋得到5個(gè)不同濃度的系列對(duì)照品溶液，在“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見(jiàn)表2；分別以各成分標(biāo)準(zhǔn)品的信噪比(S/N)等于3和10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度定為檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量混合，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷峰面積的RSD值分別為1.1%、1.3%、1.1%、1.5%、1.2%、1.9%、1.4%、1.2%、1.5%，表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批金銀花樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析并計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.1%、1.8%、1.6%、2.5%、2.2%、1.9%、2.4%、1.8%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份金銀花的樣品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件，分別于0、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.2%、1.1%、1.4%、1.2%、1.5%、0.9%、1.3%、1.1%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定同一批已知含量的金銀花樣品6份，加入適量各對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分的峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷的平均加樣回收率分別為100.5%、102.1%、99.4%、101.2%、100.5%、99.9%、100.3%、102.1%、99.6%，RSD值分別為1.7%、1.9%、2.4%、2.2%、2.5%、2.5%、2.7%、2.1%、2.6%。

2.4 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，總離子流圖見(jiàn)圖19，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖19 河南新鄉(xiāng)樣品總離子流圖

表3 5批樣品中9種核苷成分含量(μg·g-1，n=3)

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花水提液中的核苷類成分主要為尿嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、鳥苷等，尤以鳥苷和尿苷含量較高。此外，金銀花水提液中尚含有胸腺嘧啶、腺苷、環(huán)磷酸鳥苷等，但上述3種成分的含量遠(yuǎn)低于檢測(cè)的線性范圍，故未做結(jié)果展示。

本研究收集了5批金銀花樣品，由結(jié)果可見(jiàn)不同區(qū)域產(chǎn)的金銀花中核苷類成分的含量未見(jiàn)顯著差異，表明河南、河北、山東、安徽等道地產(chǎn)地產(chǎn)的金銀花質(zhì)量較穩(wěn)定。并建立了UPLC-QQQ-MS/MS同時(shí)測(cè)定金銀花飲片水提液中核苷類成分含量的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于金銀花的品質(zhì)鑒定和質(zhì)量控制。同時(shí)，亦可為金銀花的進(jìn)一步合理利用與產(chǎn)品開發(fā)提供理論支撐。