海永慧，欽倩，李蓓蓓，任靜靜，馬勛，王鵬雁，蔣建軍

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

腸外致病性大腸桿菌(Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)可通過其特有的毒力因子定殖到腸道外的其它組織中，最終導(dǎo)致宿主發(fā)病[1]。可以引起牛羊呼吸道疾病和誘發(fā)奶牛腦炎[2]、乳房炎[3]等疾病。近幾年以來，新疆規(guī)?；B(yǎng)殖場中由ExPEC引起的牛羊疾病時有發(fā)生，奶牛場的初生犢牛出現(xiàn)一種以神經(jīng)癥狀和急性死亡為特征的病例[4]。2020年顧曉曉等[5]于石河子某規(guī)模化牛場死于腦炎的犢牛大腦中也分離出大腸桿菌，分離出的牛源ExPEC菌株伴有高耐藥性，給牛源ExPEC感染的防控帶來了挑戰(zhàn)。

實驗中所用的牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織，經(jīng)鑒定為腸外致病性大腸桿菌。前期對其進(jìn)行全基因組測序及比較基因組分析，得到了69個E.coliS9922特有毒力基因，并從其中挑選了FimD、PilN和PilV 3個菌毛蛋白，進(jìn)行生物信息學(xué)分析并篩選出這3個蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢表位。本實驗將串聯(lián)這3個蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢表位，表達(dá)純化后，進(jìn)行免疫效果的評價，為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發(fā)提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗動物

牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室保存，pET32a質(zhì)粒由本實驗室保存，BL21(DE3)大腸桿菌菌株購自全式金生物，實驗動物為6～8周齡健康的昆明系小鼠。

1.2 主要試劑與耗材

DNA Marker(DL 5000 plus)購自KaTaRa公司，質(zhì)粒小提試劑盒、購自天根生化科技(北京)有限公司限制性內(nèi)切酶BamHI、限制性內(nèi)切酶XhoI、引物購自生工生物工程股份有限公司，親和層析Ni柱購自美國Bio-Rad公司，兔抗His抗體、羊抗兔IgG-HRP、兔抗鼠IgG-HRP、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多表位抗原的設(shè)計

實驗前期已經(jīng)預(yù)測出FimD蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位為：7-18、144-152、307-315、365-373；PilN蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位為:77-86、138-149、516-524。PilV蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位為：265-275、312-323、402-415。使用Linker序列GGGGS串聯(lián)FimD、PilN和PilV的優(yōu)勢B細(xì)胞表位，并在兩端加入限制性內(nèi)切酶ECORI和HindIII送去上海捷瑞生物有限公司進(jìn)行大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化，并連接到表達(dá)載體pET32a上。

1.2.2 重組蛋白表達(dá)載體的酶切鑒定

將含有目的基因的重組表達(dá)載體命名為pET32a-FimD+PilN+PilV，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3)大腸桿菌中，提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶ECORI和HindIII，在37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)酶切4 h，酶切結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

將鑒定正確的重組表達(dá)菌，接種于Amp+ LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，直至OD600值約為0.5～0.8，加入1.0 mmol·L-1的IPTG，在37 ℃、180 r·min-1條件下以不同誘導(dǎo)表達(dá)時間2、4、6 h進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)、純化及Western Blot檢測

在最優(yōu)表達(dá)條件下，進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液50 mL至離心管中，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集菌體加入8 mL Lysis Buffer，4 ℃過夜裂解菌體。將過夜裂解的菌體反復(fù)凍融3～5次后進(jìn)行超聲破碎，直到菌體清亮不掛壁。將裂解后的混合液以8 000 r·min-1，離心30 min，分別收集上清及沉淀，處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定蛋白表達(dá)形式。用鎳柱進(jìn)行重組蛋白的純化，純化后將重組蛋白放入透析袋中使用不同濃度的尿素和去離子水進(jìn)行復(fù)性，最后用蔗糖濃縮半個小時，收集蛋白并測定濃度。重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，兔抗His抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP作為二抗，進(jìn)行 Western Blot檢測。

1.2.5 小鼠免疫接種

將純化好的重組蛋白與弗氏佐劑1∶1混合，用5 mL的注射器進(jìn)行多次抽吸混合，直至形成粘稠的乳劑為止。取6～8周齡健康鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為試驗組、對照組(弗氏佐劑組和無菌PBS組)。試驗組小鼠用重組蛋白與弗氏佐劑充分乳化后，采用皮下多點注射的方式免疫小鼠，免疫劑量為50 μg·只-1，分別用等體積的弗氏佐劑與無菌PBS接種對照組小鼠。首免用弗氏完全佐劑，二免和三免均用弗氏不完全佐劑，首次免疫兩周之后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫7 d后進(jìn)行第三次免疫。

1.2.6 小鼠血清制備

將進(jìn)行免疫接種的試驗組和對照組小鼠分別隨機(jī)取3只，分別在第7天，第14天，第21天，第28天，第35天，對小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，收集血清，-20 ℃保存，用于血清特異性IgG抗體動態(tài)水平檢測。將第三次免疫后7 d的試驗組和PBS對照組小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，收集血清，-20 ℃保存，用于血清特異性抗體效價檢測。

1.2.7 血清特異性抗體檢測

用純化好的重組蛋白4 ℃過夜包被2個酶標(biāo)板，分別用于血清特異性抗體動態(tài)水平檢測和血清特異性抗體效價檢測；用TBST洗滌，5%脫脂奶粉作為封閉液，37 ℃封閉2 h；封閉完成后在1個酶標(biāo)板中加入經(jīng)過稀釋、用于血清特異性IgG抗體動態(tài)水平檢測的小鼠血清作為一抗；另一個酶標(biāo)板加入用于血清特異性抗體效價檢測的小鼠血清，按1∶100-1∶204 800梯度稀釋；37 ℃孵育1 h后，用TBST洗滌；稀釋到最適濃度的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，37 ℃孵育1.5 h，TBST洗滌后加入單組分可溶性TMB顯色液，37 ℃避光顯色5 min，加終止液終止反應(yīng)。測定OD450值。以O(shè)D待測/OD陰性≥2.1的最高稀釋倍數(shù)作為抗體血清效價。

1.2.8 攻毒保護(hù)實驗及組織載菌量測定

第三次免疫后7 d，將牛源致腦源大腸桿菌S9922菌液離心后，用PBS吹打混勻，并將菌量均調(diào)至2 LD50進(jìn)行攻毒。攻毒前12 h對小鼠禁食、禁水。對小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，并在接下來的7 d監(jiān)測各組小鼠的外觀、精神情況等進(jìn)行觀察并對小鼠死亡情況進(jìn)行記錄，計算免疫保護(hù)率。進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗7 d后，將活著的攻毒對照組和試驗組小鼠處死，在無菌條件下取摘取它們的肝臟、脾臟和腦組織，置于滅菌EP管中稱重，將組織剪碎研磨均勻后，加入1 mL滅菌PBS，進(jìn)行10倍系列稀釋，吸取100 μL倍比稀釋后的組織液涂布至LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)12～24 h，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌平板計數(shù)，計算每克組織中細(xì)菌數(shù)，用(lg CFU·g-1)表示，對結(jié)果用SPASS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白表達(dá)載體的雙酶切鑒定

轉(zhuǎn)化后的BL21(DE3)大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒后，經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切，474 bp處出現(xiàn)目的條帶如圖1所示，大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組蛋白表達(dá)載體成功構(gòu)建。

M：5 000 DNA Marker；1，2：pET32a-FimD+PilN+PilV雙酶切產(chǎn)物；3：pET32a質(zhì)粒。圖1 pET32a-FimD+PilN+PilV重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將pET32a空載體作為對照，在IPTG的誘導(dǎo)下，將重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-FimD+PilN+PilV在BL21(DE3)中表達(dá)0、2、4、6 h，將各個時間段表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在37.87 kDa處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小基本一致。隨著表達(dá)時間的增長，蛋白表達(dá)量逐漸增加，如圖2所示。重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-FimD+PilN+PilV在BL21(DE3)大腸桿菌中表達(dá)6 h后，收集菌液，經(jīng)反復(fù)凍融、超聲破碎、離心之后，收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，重組蛋白在上清和沉淀都存在，但主要以包涵體的形式表達(dá)。經(jīng)過純化后得到大小為37.87kDa的單一條帶，與預(yù)期重組蛋白的大小相符合。

M：蛋白Marker；1：空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物(8h)；2-5：重組蛋白pET32a-FimD+PilN+PilV分別在 0、2、4、6h 的表達(dá)產(chǎn)物；6：超聲破碎后上清；7：超聲破碎后沉淀；8：純化后重組蛋白。圖2 重組蛋白pET32a-FimD+PilN+PilV表達(dá)形式分析與純化結(jié)果

2.3 重組蛋白Western Blot檢測結(jié)果

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，進(jìn)行Western Blot檢測，在37.87 kDa大小處，出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的重組蛋白大小相符，重組蛋白表達(dá)成功(圖3)。

M：蛋白Marker；1：重組蛋白圖3 重組蛋白Western Blot檢測

2.4 重組蛋白免疫后特異性抗體檢測結(jié)果

重組蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，取免疫后收集的小鼠血清作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，結(jié)果顯示(圖4，表1)，試驗組在初次免疫后14 d產(chǎn)生的抗體OD450比7 d的高，初次免疫14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫后，抗體的產(chǎn)生速度顯著加快，末次免疫后抗體OD450最高。對照組幾乎檢測不到抗體的存在，采集三免后的小鼠血清，進(jìn)行抗體效價檢測，產(chǎn)生的特異性抗體效價高達(dá)1∶204 800。

圖4 重組蛋白免疫后特異性IgG動態(tài)水平

表1 重組蛋白誘導(dǎo)的特異性IgG水平

2.5 小鼠攻毒保護(hù)實驗

第三次免疫后7 d，用牛源致腦源大腸桿菌S9922對對照組和試驗組小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，PBS組小鼠在攻毒后出現(xiàn)呼吸急促、精神沉郁、喜扎堆，眼睛周圍有液體分泌物，睜不開眼，被毛散亂。試驗組小鼠攻毒后出現(xiàn)呼吸急促、精神沉郁、喜扎堆。攻毒7 d后，試驗組小鼠攻毒后存活率為66%，對照組小鼠攻毒后存活率為33%，小鼠存活情況如圖5所示。

圖5 各試驗組小鼠在牛源致腦源大腸桿菌S9922攻毒后存活情況

2.6 小鼠肝、脾、腦載菌量的測定

肝、脾、腦載菌量測定結(jié)果經(jīng)Spass軟件進(jìn)行分析后，結(jié)果如表2所示，對照組肝、脾、腦組織載菌量均顯著高于試驗組(P<0.05)。

表2 組織載菌量的測定結(jié)果(lg cfu/g)

3 討論

大腸桿菌具有復(fù)雜多變的特性，不斷地從無致病性的分離株進(jìn)化為高致病性的菌株，導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，且血清型眾多，還沒有針對致病性大腸桿菌的廣泛保護(hù)性疫苗[6]。目前用于ExPEC的疫苗主要以傳統(tǒng)滅活苗為主，但此類疫苗免疫保護(hù)效果相對比較局限，且副作用大[7]，此外，對于牛源大腸桿菌的疫苗大多都是針對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的疫苗，可用于牛源致腦炎大腸桿菌的疫苗鮮有報道。多表位疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的缺點，能更高效地刺激產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并消除針對不良表位的免疫應(yīng)答[8]。相對于傳統(tǒng)弱毒疫苗，其安全性更高[9]。

重組蛋白與佐劑充分混合制成疫苗后免疫小鼠產(chǎn)生的特異性抗體效價高達(dá)1∶204 800，攻毒后試驗組小鼠存活率為66%，以上結(jié)果說明在重組蛋白疫苗的免疫應(yīng)答中，所選表位可以引起高水平的體液免疫應(yīng)答。針對產(chǎn)生的抗體效價很高，但疫苗保護(hù)率不是很高的情況，可知，特異性IgG水平不是影響疫苗保護(hù)效果的決定因素。我們推測，其中還可能存在其他原因，疫苗產(chǎn)生的不同的IgG抗體類型也可能影響保護(hù)效果。借鑒Yates等[10]人最近在HIV疫苗中的研究發(fā)現(xiàn)可知，針對同一表位的特異性抗體，因不同的IgG亞型，產(chǎn)生不同的保護(hù)效應(yīng)。多表位疫苗由多個線性表位串聯(lián)而成，在重組蛋白的不同折疊方式可能導(dǎo)致了新表位的產(chǎn)生，在弗氏佐劑作用下，有較多的新表位激起了抗體應(yīng)答，但該新表位并不發(fā)揮保護(hù)作用[8]。又由于大腸桿菌的血清型較多，不同血清型間存在一定的交叉免疫反應(yīng)，針對一種血清型的重組蛋白抗原，不能完全保護(hù)其他血清型大腸桿菌的感染；腸外致病性大腸桿菌又含有多個毒力因子，所以想要提高疫苗的保護(hù)效果，除了要考慮多血清型的問題，還要考慮不同毒力因子的問題；實驗中進(jìn)行攻毒實驗的小鼠數(shù)量較少，且沒有重復(fù)做攻毒保護(hù)實驗進(jìn)行驗證，可能對攻毒保護(hù)率的測定有一定的影響。

本實驗中選取的B細(xì)胞表位都是線性B細(xì)胞表位，而構(gòu)象表位也在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用方面發(fā)揮重要作用[11]。其次B細(xì)胞主要增強(qiáng)體液免疫，細(xì)胞免疫還需要T細(xì)胞?？辜?xì)菌感染過程中，有學(xué)者研究表明，細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答共同發(fā)揮作用。一些疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答，但是并不能有效的預(yù)防感染[9]。有研究報道，在預(yù)防金黃色葡萄球菌定殖和感染過程中，T細(xì)胞和B細(xì)胞共同發(fā)揮作用[12]。使用單個T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位構(gòu)成的表位疫苗免疫接種小鼠，由于誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方式較為單一，并不能有效地抑制小鼠體內(nèi)的細(xì)菌定殖。與單一表位相比，由T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位構(gòu)成的表位疫苗能顯著地抑制了金黃色葡萄球菌在小鼠各臟器中的定殖[13]。

pET32a-FimD+PilN+PilV重組蛋白多表位疫苗誘導(dǎo)了高水平的體液免疫應(yīng)答，并且顯著減少了牛源致腦炎大腸桿菌在小鼠臟器中的定殖，具有成為牛源致腦炎大腸桿菌多表位抗原候選疫苗的潛力。本實驗只選用了FimD、PilN和PilV 3個蛋白的B細(xì)胞線性表位，如果增加這3個蛋白的T細(xì)胞表位是否會提高表位疫苗的保護(hù)效果，從而更有效地預(yù)防牛源致腦炎大腸桿菌，值得進(jìn)一步研究。