李 楊 馬召蕾 鄭 麗 黃雨洋 金技峰 滕 飛

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150030；3.張哲九平壤商業(yè)大學(xué)給養(yǎng)系，平壤 950003)

0 引言

大豆分離蛋白(Soybean protein isolate，SPI)是大豆油脂工業(yè)加工副產(chǎn)物，主要由7 S(β-伴大豆球蛋白)和11 S(大豆球蛋白)兩種球形蛋白組成，因其基本氨基酸組成均衡，具有良好的營養(yǎng)特性和應(yīng)用價值，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1-2]。然而，未改性SPI由于其三級、四級結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，具有緊密堆疊的致密球形構(gòu)象，其功能特性在食品工業(yè)的應(yīng)用往往受到許多限制，例如其凝膠性、乳化性、起泡性等[3]。大豆分離蛋白的凝膠性等功能特性可以通過改性得到改善，這對SPI在食品行業(yè)和非食品行業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的意義[4]。

近年來，超聲和酶改性常被用于SPI的改性。超聲作為物理改性手段，利用超聲波的機(jī)械和空化作用破壞蛋白顆粒間的非共價作用，從而引起SPI結(jié)構(gòu)狀態(tài)改變，進(jìn)而改善其理化性質(zhì)和功能特性[5-6]。酶改性作為主要生物改性手段，利用蛋白酶在溫和條件下的催化作用使SPI結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出蛋白分子內(nèi)的疏水性基團(tuán)，達(dá)成對蛋白質(zhì)改性使其功能特性改善的目的。目前，大豆分離蛋白酶改性常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等，常被用于改善SPI的功能特性。其中，木瓜蛋白酶由于具有廣泛的酶解位點(diǎn)(例如精氨酸、賴氨酸羧基端肽鍵等)，且木瓜蛋白酶對SPI進(jìn)行限制性酶解后可以暴露出更多的賴氨酸殘基利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶后續(xù)的交聯(lián)反應(yīng)，而被用于改善SPI的凝膠特性[7-8]。文獻(xiàn)[9]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶限制性水解使SPI凝膠強(qiáng)度和持水性分別提升了58.7%和6.4%左右。文獻(xiàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)，中等振幅較短時間的超聲處理效果較好，可對SPI凝膠性產(chǎn)生有利影響。文獻(xiàn)[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以降低SPI粒徑，提升SPI表面疏水性，促進(jìn)TG交聯(lián)SPI形成蛋白凝膠。目前，單一改性方式對SPI結(jié)構(gòu)和TG交聯(lián)SPI凝膠特性影響的研究報道很多，而超聲聯(lián)合酶改性對TG交聯(lián)SPI凝膠特性影響的研究鮮見報道，并且單一的改性方式對蛋白功能特性的提升效果有限。

因此，本文以大豆分離蛋白為原料，運(yùn)用超聲聯(lián)合酶改性手段處理SPI，探討超聲聯(lián)合酶改性對SPI結(jié)構(gòu)特性的改變，以及其對TG交聯(lián)SPI凝膠特性的影響，通過粒度、游離巰基含量和表面疏水性分析，內(nèi)源性熒光光譜和傅里葉紅外變換光譜、質(zhì)構(gòu)以及掃描電鏡測試等方法，研究超聲聯(lián)合酶改性后SPI結(jié)構(gòu)特性和功能特性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.2%)，河南川錦生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力800 000 U/g)、無水四硼酸鈉、鄰苯二甲醛(OPA)，上海源葉生物科技有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(酶活力100 U/g)，北京索萊寶生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、甘氨酸、L-絲氨酸，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DJ1C-120W型增力電動攪拌器、S22-2型磁力攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；AUY120型電子天平、UV-2600/2700型紫外-可見分光光度計，島津儀器(中國)有限公司；Nano-ZS 90型粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Nicolet is50型傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TA-XT型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；S-3400型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1樣品制備

(1)超聲改性樣品

根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法稍作修改，將SPI分散于蒸餾水中(液料比10 mL/g)，在室溫(25℃)下攪拌2 h制備SPI分散液，維持分散液pH值為7.0。將SPI分散液在功率300 W下超聲處理20 min(工作/間歇時間為5 s/1 s)。在超聲處理過程中，將探頭保持在SPI分散液表面以下1～2 cm處。將超聲處理后的SPI分散液樣品冷凍干燥，然后放入干燥器中保存直至分析測定。將超聲改性樣品記為USPI。

(2)木瓜蛋白酶改性樣品

根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法稍作修改，將SPI分散于蒸餾水中(液料比10 mL/g)，在室溫下攪拌2 h制備SPI分散液。將分散液在pH值7.0、50℃條件下進(jìn)行改性處理，木瓜蛋白酶用量為25 U/g，在50℃恒溫水浴鍋中水解30 min，使其充分反應(yīng)，在90℃下滅酶10 min。將酶解改性后的SPI分散液樣品凍干，然后放入干燥器中保存直至分析測定。將木瓜蛋白酶酶解改性樣品記為ESPI。

(3)超聲聯(lián)合酶改性樣品

將SPI分散于蒸餾水中(液料比10 mL/g)，室溫下攪拌2 h制備SPI分散液。將分散液在功率300 W下超聲處理20 min，然后在pH值7.0、50℃條件下進(jìn)行改性處理，木瓜蛋白酶用量為25 U/g，在50℃恒溫水浴鍋中水解30 min，使其充分反應(yīng)，最后在90℃下滅酶10 min，凍干并保存。將超聲聯(lián)合酶改性樣品記為UESPI。

1.3.2水解度測定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改，采用OPA法測定蛋白質(zhì)的水解度。其原理是OPA在1,4-二巰基蘇糖醇(DTT)的存在下會與自由α-氨基形成黃色化合物，其在340 nm處有特征吸收，用紫外-可見分光光度計可檢測其OD(光密度)值。

將600 μL樣品水解液加入到裝有4.5 mL OPA試劑的試管中(時間點(diǎn)設(shè)為0)，混合均勻后靜置2 min，讀取340 nm處的吸光度。使用600 μL去離子水和絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別制備空白和標(biāo)準(zhǔn)品。樣品水解度的計算公式為

(1)

(2)

(3)

式中htot——每克蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)，取7.8

α、β——大豆蛋白常量，取0.97、0.342

AS——樣品吸光度

AB——空白吸光度

AC——標(biāo)準(zhǔn)品吸光度

V——樣品體積，L

X——樣品質(zhì)量，g

P——樣品中可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

1.3.3粒度測定

將樣品分散于蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，顆粒折射率和分散劑折射率分別為1.460和1.330。采用馬爾文納米力度測定儀測定樣品的粒度，每一個樣品進(jìn)行平行3次測量。

1.3.4傅里葉變換紅外光譜

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法稍作修改，用Nicolet is50型傅里葉變換紅外光譜儀在室溫下記錄了SPI的紅外光譜。將樣品與KBr粉末按質(zhì)量比1∶100混合研磨，然后壓片。然后利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行全波段掃描(400～4 000 cm-1)，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit 4.12軟件，高斯曲線擬合方法擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的特征峰，分析其相對含量[10]。

1.3.5內(nèi)源熒光光譜

根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法稍作修改，采用F-4500型熒光分光光度計測定大豆分離蛋白的熒光光譜。將樣品分散于磷酸鹽緩沖液(濃度為0.01 mol/L，pH值為7.0)中，配制成適合濃度的蛋白溶液，激發(fā)波長為290 nm，掃描發(fā)射光譜范圍為300～500 nm，進(jìn)行熒光光譜分析。

1.3.6游離巰基含量測定

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法稍作修改，分別取15 mg樣品溶于5 mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH值8.0)中，使用快速混勻器漩渦振蕩溶解。然后向該蛋白溶液中加入50 μL Ellman試劑(4 mg DTNB溶于1 mL Tris-甘氨酸緩沖液)，漩渦混勻后將懸浮液置于室溫下避光保溫1 h，然后在10 000g條件下離心15 min。取上清液測定游離巰基含量，以未加蛋白的混合液作空白對照，使用紫外可見分光光度計測定412 nm處的吸光度A412。游離巰基含量計算公式為

SH=[106/(1.36×104)A412D]/C

(4)

式中SH——游離巰基質(zhì)量摩爾濃度,μmol/g

D——稀釋系數(shù)

C——樣品最終質(zhì)量濃度，mg/mL

1.3.7表面疏水性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法稍作修改，將不同SPI樣品各0.01 g溶于10 mL磷酸鹽緩沖液(pH值7.0、濃度0.01 mol/L)中，使樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL。然后用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋到一系列質(zhì)量濃度(0.062 5～1 mg/mL)。取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品10 mL加入100 μL ANS(8-苯胺-1-萘磺酸，8 mmol/L)，混勻，黑暗中靜置30 min。采用熒光分光光度計在激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長485 nm處測定樣品的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作曲線，曲線斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.3.8凝膠制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法稍作修改，進(jìn)行凝膠樣品的制備。將SPI樣品分散于蒸餾水中(液料比10 mL/g)，攪拌使其充分溶解，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(20 U/g)，攪拌均勻。將其置于50℃下加熱45 min，取出冷卻至室溫，將樣品放置在4℃條件下靜置12 h，制成凝膠。

1.3.9凝膠強(qiáng)度測定

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法稍作修改，將凝膠切成圓柱形(直徑20 mm、高度10 mm)，利用TA-XT型質(zhì)構(gòu)儀測定樣品的凝膠強(qiáng)度。使用P/36R型探頭，觸發(fā)力0.029 4 N，下降高度10 mm，測前速度為5.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測后速度5.0 mm/s。

1.3.10凝膠持水性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法稍作修改，每個樣品取一定量凝膠置于離心管中，記錄凝膠質(zhì)量為m，離心管和凝膠總質(zhì)量為m1，并在4℃下以8 000g離心15 min，除去離心管內(nèi)的水分，測離心管及凝膠質(zhì)量m2。持水率計算公式為

(5)

1.3.11凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法稍作修改，將凝膠樣品切成尺寸2 mm×5 mm的小條，用2.5%戊二醛(pH值 6.8)固定，4℃保存。先用0.1 mol/L、pH值 6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗2次，再用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%的乙醇溶液分別脫水一次，無水乙醇脫水3次，然后用無水乙醇與叔丁醇體積比為1∶1的混合液和純叔丁醇各置換1次。冷凍干燥后進(jìn)行離子漸射鍍金，于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)分析，當(dāng)P<0.05時差異性顯著，使用 Origin 2019制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒度分析

蛋白質(zhì)粒徑是影響其功能特性的主要因素之一。不同方式處理后SPI粒徑如圖1(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示，與未經(jīng)處理的SPI相比，經(jīng)超聲處理的SPI溶液平均粒徑顯著降低(P<0.05)，這可能是由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)減弱蛋白分子之間的相互作用，降低蛋白分子之間的聚集。這與文獻(xiàn)[22]研究超聲改性對大豆分離蛋白凝膠凍融穩(wěn)定性影響時得到超聲改性使SPI粒徑降低結(jié)果相似。經(jīng)木瓜蛋白酶處理的SPI與未經(jīng)處理的SPI相比，其平均粒徑顯著降低(P<0.05)，其水解度約為0.1%。這是由于SPI經(jīng)過木瓜蛋白酶的限制性水解作用，被部分切割成小分子片段，從而使SPI粒徑降低。而與經(jīng)超聲處理的SPI相比，其平均粒徑略有升高，這可能是由于SPI結(jié)構(gòu)較為致密，酶解位點(diǎn)被一定程度包埋，減弱了木瓜蛋白酶對SPI的酶解作用[23]。經(jīng)超聲聯(lián)合酶處理的SPI溶液平均粒徑最低，其水解度約為0.5%，這可能是由于經(jīng)超聲預(yù)處理后，蛋白結(jié)構(gòu)展開，酶解位點(diǎn)暴露，改善了木瓜蛋白酶對SPI的水解效果[5]。

圖1 超聲與酶處理對SPI溶液粒徑的影響Fig.1 Effect of ultrasound and enzyme treatments on the particle size of SPI solutions

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜可以用來分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，SPI二級結(jié)構(gòu)相對含量如表1所示。去酰胺Ⅰ帶光譜(1 600～1 700 cm-1)被用來分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，吸收峰與其對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)如下：α-螺旋為1 650～1 660 cm-1；β-轉(zhuǎn)角為1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1；β-折疊為1 610～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1；無規(guī)則卷曲為1 640～1 650 cm-1[24]。由表1可知，與未經(jīng)處理的SPI相比，經(jīng)不同改性方式處理的SPI樣品α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量均顯著降低(P<0.05)，β-折疊和無規(guī)則卷曲相對含量均顯著上升(P<0.05)，這表明不同處理方式均可以對SPI二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。其中，經(jīng)超聲聯(lián)合酶處理的SPI二級結(jié)構(gòu)變化最為明顯，表明兩種改性方式有協(xié)同作用。文獻(xiàn)[25]研究木瓜蛋白酶限制性水解大豆分離蛋白時，SPI的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量降低、β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)文獻(xiàn)[26]的研究結(jié)果可知，SPI的二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊結(jié)構(gòu)來維持。β-折疊結(jié)構(gòu)的增加改變了蛋白質(zhì)間的相互作用，β-折疊結(jié)構(gòu)在維持蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中起重要作用，這也為改性處理后SPI的凝膠性提高提供了理論基礎(chǔ)[27]。

表1 超聲與酶處理SPI的二級結(jié)構(gòu)相對含量Tab.1 Secondary structure of SPI under ultrasound and enzyme treatments %

2.3 熒光光譜分析

當(dāng)激發(fā)波長為290 nm時，SPI熒光發(fā)射光譜主要是由蛋白質(zhì)內(nèi)部色氨酸的熒光強(qiáng)度變化形成的，色氨酸的熒光強(qiáng)度變化是由蛋白質(zhì)發(fā)生折疊或展開引起的。通常情況下，最大吸收波長紅移表明熒光發(fā)射基團(tuán)暴露在溶劑中，蛋白質(zhì)分子展開；藍(lán)移則表明大豆分離蛋白發(fā)生了聚集等變化[28]。本研究通過熒光光譜來表征大豆分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化，如圖2所示，與未改性SPI相比，經(jīng)超聲改性的SPI熒光光譜沒有發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，最大吸收波長仍為334 nm，但是其熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)，這是因?yàn)槌暣偈沟鞍追肿咏Y(jié)構(gòu)展開，從而導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)暴露[29]。而經(jīng)木瓜蛋白酶處理的SPI熒光光譜發(fā)生了紅移現(xiàn)象，最大吸收波長從334 nm移至336 nm，且熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)，文獻(xiàn)[30]研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白經(jīng)酶修飾后最大熒光值出現(xiàn)紅移，且熒光強(qiáng)度顯著升高，這與本研究的結(jié)果一致。超聲聯(lián)合酶處理的SPI熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，最大吸收波長紅移至338 nm，進(jìn)一步表明超聲處理和木瓜蛋白酶處理之間的協(xié)同作用，使蛋白結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)色基團(tuán)暴露，熒光強(qiáng)度增加[28]。

圖2 超聲與酶處理SPI的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of SPI under ultrasound and enzyme treatments

2.4 游離巰基含量

游離巰基位于SPI分子表面，其含量對SPI功能特性有很大影響，尤其在蛋白的凝膠性方面。游離巰基可能通過過氧化形成二硫鍵從而對凝膠的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能有積極影響[18]。不同樣品游離巰基含量的測定結(jié)果如圖3所示，與未經(jīng)處理的SPI相比，經(jīng)不同方式處理的SPI游離巰基含量均顯著升高(P<0.05)。超聲處理的SPI游離巰基含量升高，主要是由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)使蛋白結(jié)構(gòu)展開，使得包埋在蛋白內(nèi)部的游離巰基暴露到分子表面[31-33]。木瓜蛋白酶處理的SPI游離巰基含量升高，可能是由于木瓜蛋白酶水解SPI引起的蛋白結(jié)構(gòu)伸展和二硫鍵斷裂導(dǎo)致[7]。相比于前3種樣品，超聲聯(lián)合酶處理的SPI游離巰基含量顯著升高(P<0.05)，這可能是由于超聲與木瓜蛋白酶之間的協(xié)同作用，使蛋白結(jié)構(gòu)更加松散，二硫鍵斷裂，內(nèi)部的游離巰基暴露出來[28]。

圖3 超聲與酶處理SPI的游離巰基含量Fig.3 Free sulfhydryl content of SPI under ultrasound and enzyme treatments

2.5 表面疏水性分析

蛋白的表面疏水性可以體現(xiàn)極性環(huán)境中蛋白表面疏水基團(tuán)的數(shù)量，是評估在極性條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能性質(zhì)的重要指標(biāo)，并且它與蛋白凝膠性密切相關(guān)[25]。由圖4可知，與未改性SPI相比，經(jīng)不同改性方式處理的SPI表面疏水性均顯著升高(P<0.05)。經(jīng)超聲處理的SPI表面疏水性升高，這是由于超聲作用使蛋白分子結(jié)構(gòu)展開、疏水基團(tuán)暴露，使蛋白表面疏水性增大[34]。經(jīng)木瓜蛋白酶處理的SPI表面疏水性升高，這可能是由于木瓜蛋白酶處理使SPI結(jié)構(gòu)展開，二硫鍵斷裂，包埋在SPI內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，從而表面疏水性升高[35]。這與文獻(xiàn)[36]研究的木瓜蛋白酶酶解處理使SPI疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性升高的結(jié)果一致。超聲聯(lián)合酶處理的SPI與單一方式處理的SPI相比，表面疏水性的升高極為明顯，這表明超聲處理的機(jī)械力和空化作用與木瓜蛋白酶的水解作用相互協(xié)同，使SPI的致密結(jié)構(gòu)得以展開，酶水解作用一定程度加強(qiáng)，疏水基團(tuán)更多地暴露，增強(qiáng)了SPI的表面疏水性[23]。

圖4 超聲與酶處理SPI的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of SPI under ultrasound and enzyme treatments

2.6 凝膠強(qiáng)度和持水性分析

凝膠強(qiáng)度和持水性是蛋白凝膠的重要特性，經(jīng)超聲聯(lián)合酶處理的SPI凝膠強(qiáng)度和持水率顯著升高(P<0.05)，結(jié)果如圖5所示，其凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的未改性SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度和持水率分別為75.41 g和51.83%。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的經(jīng)超聲處理的SPI凝膠強(qiáng)度和持水率分別為169.00 g和84.36%，相較于未經(jīng)處理的SPI分別提升了(124.09±2.47)%和(62.80±2.46)%。這是由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)使SPI結(jié)構(gòu)展開，粒徑減小，活性基團(tuán)暴露在分子表面，從而使SPI在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)作用下形成的凝膠結(jié)構(gòu)孔洞變小，從而使凝膠強(qiáng)度和持水性升高[37-38]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的經(jīng)木瓜蛋白酶處理的SPI凝膠強(qiáng)度和持水率分別為205.22 g和90.67%，相較于未經(jīng)處理的SPI分別提升了(172.14±8.21)%和(74.96±1.66)%。研究顯示，SPI經(jīng)木瓜蛋白酶特異性酶解，暴露出賴氨酸殘基，利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)形成較為均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使凝膠的強(qiáng)度和持水性升高[7]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的經(jīng)超聲聯(lián)合酶處理的SPI凝膠強(qiáng)度和持水率分別為284.96 g和98.20%，相較于未經(jīng)處理的SPI分別提升了(278.04±18.81)%和(89.51±2.78)%，與單一處理的SPI相比，其凝膠強(qiáng)度和持水率也顯著增加(P<0.05)。這可能是由于超聲處理使蛋白結(jié)構(gòu)展開，粒徑減小，更加利于木瓜蛋白酶的特異性酶解，暴露出更多的賴氨酸殘基等活性基團(tuán)，更加利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)作用，形成均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)，從而使凝膠的強(qiáng)度和持水性顯著升高，這也進(jìn)一步證明了超聲與木瓜蛋白酶處理之間的協(xié)同作用[39-40]。

圖5 超聲與酶處理SPI的凝膠強(qiáng)度和持水率Fig.5 Strength and water holding capacity of SPI gel under ultrasound and enzyme treatments

圖6 超聲與酶處理SPI的凝膠微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructures of SPI gel under ultrasound and enzyme treatments

2.7 微觀結(jié)構(gòu)

通過掃描電子顯微鏡[41]可以直觀地觀察不同樣品經(jīng)TG交聯(lián)形成的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)。從圖6可以看出，未經(jīng)處理的SPI凝膠樣品(圖6a～6c)存在較大的孔洞，且相較于其它經(jīng)過處理的凝膠樣品，其結(jié)構(gòu)松散、凝膠表面粗糙。經(jīng)超聲處理的SPI凝膠樣品(圖6d～6f)，表面的孔洞明顯減少、結(jié)構(gòu)變得致密，但凝膠表面仍比較粗糙。說明超聲處理降低了蛋白粒徑，使蛋白結(jié)構(gòu)展開、活性基團(tuán)暴露于蛋白表面，促進(jìn)TG交聯(lián)形成更加致密的凝膠結(jié)構(gòu)[38]。經(jīng)木瓜蛋白酶處理的SPI凝膠樣品(圖6g～6i)，表面緊密均勻、孔隙減少，粗糙程度也有所降低。這是由于木瓜蛋白酶的限制性酶水解破壞了SPI的二硫鍵，蛋白結(jié)構(gòu)伸展，暴露出一定的賴氨酸殘基，有利于TG交聯(lián)成更加均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)[9]。經(jīng)超聲聯(lián)合酶處理的SPI凝膠樣品(圖6j～6l)，表面光滑平整、均勻致密，孔隙小。這是由于超聲處理降低蛋白分子之間的相互作用，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，有利于木瓜蛋白酶的特異性酶解，暴露出更多的賴氨酸殘基等活性基團(tuán)，更加利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)作用，形成表面光滑、均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)[7]。

3 結(jié)束語

以大豆分離蛋白為原料，探究超聲聯(lián)合酶處理對SPI結(jié)構(gòu)以及對TG交聯(lián)的SPI凝膠性能的影響，主要得出以下結(jié)論：不同處理方式均可以提高SPI熒光強(qiáng)度，其中超聲聯(lián)合酶處理效果最佳，兩種方式的協(xié)同作用使蛋白結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)色基團(tuán)暴露，熒光強(qiáng)度增加。同時，超聲聯(lián)合酶處理也顯著降低了SPI的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量，并提高了β-折疊和無規(guī)則卷曲相對含量。超聲處理產(chǎn)生的機(jī)械力及空化效應(yīng)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，協(xié)同木瓜蛋白酶處理破壞SPI二硫鍵，暴露出更多的疏水基團(tuán)和游離巰基，提升了SPI表面疏水性和游離巰基含量，比單一處理的提升效果更明顯。超聲聯(lián)合酶處理可以顯著提高TG交聯(lián)的SPI凝膠強(qiáng)度和持水性能，超聲處理使蛋白結(jié)構(gòu)展開，利于木瓜蛋白酶的特異性酶解，暴露出更多的賴氨酸殘基等活性基團(tuán)，有利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)作用，形成均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)。