馬小軍，王加冕，李世瑛，顏麗嬌，麻強(qiáng)生，張小麗

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.申聯(lián)生物股份有限公司，甘肅 蘭州 730070；3.新疆昌吉市大西渠鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆 昌吉 831100)

動(dòng)物乳腺炎是由多種因素作用引起的乳腺炎癥，最常見的致病因素為病原微生物感染[1-2]。動(dòng)物乳腺炎的病原微生物種類繁多，多達(dá)150種以上，最為常見的病原微生物是細(xì)菌、病毒、支原體及真菌等，其中大腸桿菌占我國(guó)奶牛乳房炎臨床分離病原菌總量的14.4%[3]。大腸桿菌性乳腺炎有2個(gè)最為顯著的特點(diǎn)，即流行性和急性；大腸桿菌屬于環(huán)境性致病菌，飲水、糞便、泥土、墊料及擠奶工具等都會(huì)成為其傳播介質(zhì)；大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，具有LPS、外毒素、黏附素及莢膜等多種致病力較強(qiáng)的毒性物質(zhì)，大腸桿菌通過動(dòng)物乳腺侵入血循環(huán)，細(xì)菌突破機(jī)體防御機(jī)制后在血液中生長(zhǎng)、定居、繁殖并釋放毒素，最終引起機(jī)體全身急性敗血癥，從而導(dǎo)致動(dòng)物泌乳量減少、生產(chǎn)性能降低甚至急性死亡[4]。成纖維細(xì)胞的功能包括構(gòu)成結(jié)締組織、參與膠原纖維形成、分泌免疫蛋白、修復(fù)創(chuàng)傷及防治疾病，電鏡觀察可見成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和高爾基體，這表明成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)大的合成及分泌蛋白功能；Picard等[5]、Davidson等[6]及von Bernuth等[7]研究指出，成纖維細(xì)胞可被用來定位并研究病原體檢測(cè)和信號(hào)通路，其分泌的免疫蛋白可參與機(jī)體的免疫活動(dòng)，在抗擊感染中發(fā)揮重大作用，不少國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)也都預(yù)示著乳腺成纖維細(xì)胞的免疫機(jī)制在乳腺炎防治中有著重大意義。

TLRs是非特異性免疫系統(tǒng)中的主要模式識(shí)別受體，具有感知病原體侵襲、刺激免疫信號(hào)通路活化及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重大功能；TLRs不僅參與機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，同時(shí)也是維系機(jī)體先天性與獲得性免疫的關(guān)鍵樞紐。1997年，Medzhitov等[8]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)存在于人體細(xì)胞表面的Toll樣受體蛋白，它可激活適應(yīng)性免疫有關(guān)基因，同時(shí)在人體抗感染免疫中有重要意義，該蛋白后來被稱為TLR4；隨后Poltorak等[9]發(fā)現(xiàn)TLR4可識(shí)別內(nèi)毒素(LPS)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR4突變而喪失功能的小鼠對(duì)LPS并無反應(yīng)，從而推測(cè)TLR4是LPS的特異性識(shí)別受體[10]。急性大腸桿菌乳腺炎的核心階段是大腸桿菌細(xì)胞壁上的LPS與細(xì)胞膜表面受體TLR4的識(shí)別，目前TLR4與綿羊乳腺炎的相關(guān)報(bào)道甚少，Goldammer等[11]為了分析先天免疫系統(tǒng)在抵抗乳腺感染中的作用，測(cè)定了健康和受感染的乳腺組織中TLR9、TLR2、TLR4、BNBD5的mRNA豐度，結(jié)果顯示，除TLR9外，其他基因在受感染組織中mRNA豐度均顯著增加 (4～13倍)，這表明TLR4與先天性免疫系統(tǒng)在抵御乳腺炎中有著重大作用；王興平等[12]對(duì)牛TLR4基因的遺傳多態(tài)性與乳腺炎的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究，他們分析并指出TLR4基因可能作為奶牛乳房炎抗性的候選基因。

目前，我國(guó)對(duì)于治療乳腺炎常用抗生素療法，該療法副作用大且易增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性；機(jī)體的免疫反應(yīng)作為機(jī)體抵抗病原微生物感染的重要途徑，具有重大研究?jī)r(jià)值與意義。由于TLR4作為L(zhǎng)PS的特異性識(shí)別受體，其在大腸桿菌性乳腺炎中必定扮演著重要角色，了解TLR4在大腸桿菌引發(fā)細(xì)胞損傷中的具體分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有助于更清晰地認(rèn)識(shí)大腸桿菌性乳腺炎；通過研究大腸桿菌對(duì)細(xì)胞損傷的影響，探究LPS特異性識(shí)別受體TLR4對(duì)乳腺炎發(fā)生發(fā)展的影響，有助于在分子水平了解機(jī)體自身的免疫機(jī)制，發(fā)掘機(jī)體的免疫能力以提高自身抗病性能，為有效防治乳腺炎提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑：Giemsa染液、細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、caspase-4，5活性測(cè)定試劑盒、高效細(xì)胞裂解液，索萊寶；DME/F-12細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，HyClone；FBS，Biological Industries；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒，建成；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，諾唯贊；TRIzol，Ambion；TLR4 阻斷劑 CLI-095，InvivoGen；GEN，Biofroxx；0.22 μm PVDF 膜，Millipore；兔抗TLR4抗體，兔抗β-Actin抗體，羊抗兔IgG H&L標(biāo)記抗體，博奧森。

主要儀器：梯度基因擴(kuò)增儀，德國(guó)Eppendorf；qRT-PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems；瓊脂糖凝膠成像儀，美國(guó)BIO-RAD；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國(guó)Beckman Coucter；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek；超微分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊乳腺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) 酶消化法結(jié)合差速消化法獲得乳腺成纖維細(xì)胞[13]。選擇處于泌乳期且無乳腺炎病史的健康小尾寒羊，飼養(yǎng)觀察14 d后無異?，F(xiàn)象采集綿羊乳腺組織，剪碎組織后加入消化液(DME/F-12培養(yǎng)基中含 200 U/mL Ι 型膠原酶及120 U/mL透明質(zhì)酸酶)消化3 h，收集細(xì)胞懸液于細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，純化時(shí)使0.05%胰蛋白酶消化 2 min收集成纖維細(xì)胞。

1.2.2 Giemsa染色法鑒定乳腺成纖維細(xì)胞 成纖維細(xì)胞的鑒定采用Giemsa染色法。細(xì)胞爬片上細(xì)胞貼壁面積達(dá)80%后用預(yù)冷PBS洗3次，混合液(PBS∶甲醇= 1∶1)染色2 min，甲醇固定后Giemsa染色2 min[14]，蒸餾水洗去染液后顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率[15]。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/mL，96孔板中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5，1，2，3，4 d，設(shè)置調(diào)零孔，每組6個(gè)重復(fù)；MTT染色后加入Formazan溶解液振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD492。

1.2.4 LDH法篩選大腸桿菌最適感染比 采用微量酶標(biāo)法檢測(cè)大腸桿菌感染細(xì)胞后培養(yǎng)上清液中LDH的釋放量[16]。96孔板中細(xì)胞貼壁90%以上后棄培養(yǎng)液，將大腸桿菌按照MOI=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 人工感染細(xì)胞 1，2，3，4，5 h，設(shè)置對(duì)照組不感染大腸桿菌，每組4個(gè)重復(fù)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。根據(jù)說明書操作后測(cè)定OD450，計(jì)算LDH 的活力(單位：U/L)，即LDH 釋放量。

1.2.5 qPCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子caspase-3基因表達(dá) 采用TRIzol法提取綿羊乳腺成纖維細(xì)胞總RNA[17]，超微分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度與濃度。2步法合成cDNA：4×gDNA wiper Mix，4 μL；RNA模板，1 μg；DEPC水補(bǔ)充總體積至16 μL；42 ℃反應(yīng)2 min；向16 μL混合液中加入4 μL 5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ；50 ℃反應(yīng) 15 min，85 ℃反應(yīng) 5 s。qRT-PCR 使用 25 μL反應(yīng)體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，12.5 μL；DEPC水，8.5 μL；上、下游引物各 1 μL(表1)；模板 2 μL。95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s。根據(jù)所得Ct值計(jì)算caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用 2-ΔΔCt表示。

表1 綿羊caspase-3引物信息Tab.1 Sheep caspase-3 primer information

1.2.6 比色法檢測(cè)細(xì)胞焦亡蛋白caspase-4，5 酶活性變化 收集細(xì)胞蛋白裂解液至離心管中，Bradford法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度。根據(jù)說明書操作，設(shè)置空白組、對(duì)照組及試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)底物最后加入以確保反應(yīng)起始時(shí)間相同。37 ℃培養(yǎng)至肉眼觀察板內(nèi)液體變黃后測(cè)定OD405，計(jì)算細(xì)胞蛋白裂解液中caspase-4，5的活性變化百分比。

1.2.7 qRT-PCR及WB檢測(cè)TLR4的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)TLR4的表達(dá)參照1.2.5，綿羊TLR4引物信息如表 2 所示。WB檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)，RIPA收集細(xì)胞總蛋白上清液，BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度，蛋白變性后收集上清進(jìn)行蛋白印跡分析[18]。目的蛋白TLR4的分子量大小為93 ku，選取5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，收集膠塊后轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于孵育盒中，5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，熒光標(biāo)記二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h；取Signal Fire ECL試劑滴于膜表面，化學(xué)發(fā)光儀顯色曝光。

表2 綿羊TLR4引物信息Tab.2 Sheep TLR4 primer information

1.2.8 MTT法檢測(cè)TLR4阻斷劑CLI-095的細(xì)胞毒性作用 細(xì)胞于96孔板中長(zhǎng)至單層后進(jìn)行試驗(yàn)，每孔加入100 μL TLR4阻斷劑CLI-095(終濃度1 μg/mL)，37 ℃孵育細(xì)胞0.5，1，2 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，方法參照 1.2.3；同時(shí)設(shè)置不使用阻斷劑的細(xì)胞作為對(duì)照組，每組6個(gè)重復(fù)。

1.2.9 qRT-PCR檢測(cè)CLI-095對(duì)TLR4的阻斷效果 非阻斷組處理：大腸桿菌感染綿羊乳腺成纖維細(xì)胞(MOI=4∶1)，37 ℃培養(yǎng)1 h；阻斷組處理：每孔加入100 μL TLR4阻斷劑CLI-095(1 μg/mL)，37 ℃孵育1 h，大腸桿菌感染細(xì)胞1 h(MOI=4∶1)，每組3個(gè)重復(fù)。參照1.2.5，利用qRT-PCR法檢測(cè)各組別TLR4mRNA的相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證CLI-095的阻斷效果。

1.2.10 平板活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)CLI-095對(duì)大腸桿菌黏附乳腺成纖維細(xì)胞的影響 細(xì)菌感染細(xì)胞 4 h后PBS洗去未黏附的細(xì)菌；每孔加入 1 mL 1% Triton X-100室溫通透處理10 min，收集裂解液后平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌黏附數(shù)，每組取 200 μL細(xì)胞裂解液平板涂布，每組3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌黏附數(shù)(單位：cfu/mL)=3個(gè)平板菌落平均數(shù)×5×稀釋倍數(shù)，阻斷率=(非阻斷組-阻斷組)/非阻斷組×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 、P<0.01 或P<0.001 表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，利用OriginProPorable軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊乳腺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)及純化結(jié)果如圖 1 所示，圖 1 左為原代培養(yǎng)所得到的乳腺細(xì)胞，細(xì)胞貼壁狀況良好且形態(tài)特征明顯，綿羊乳腺成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭狀、乳腺上皮細(xì)胞為鋪路石狀；圖 1 右為純化后的乳腺成纖維細(xì)胞，細(xì)胞純度達(dá)90%以上。Giemsa染色如圖 2 所示，成纖維細(xì)胞染色后呈藍(lán)紫色、邊緣光滑、排列整齊。

圖1 乳腺成纖維細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Mammary fibroblast morphology

圖2 乳腺成纖維細(xì)胞Giemsa染色Fig.2 Giemsa staining of mammary fibroblasts

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

在細(xì)胞培養(yǎng)1～4 d內(nèi) 490 nm處OD值隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，說明細(xì)胞增殖率逐漸升高，反映細(xì)胞活力良好(圖3)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4，6—9，11同。

2.3 LDH法篩選最適MOI比值

當(dāng)MOI為 1∶1、2∶1、3∶1、5∶1時(shí)，LDH釋放量均為不規(guī)則變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)MOI比值為4∶1。時(shí)，大腸桿菌感染乳腺成纖維細(xì)胞1～5 h內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量分別為75.81，95.46，188.27，213.36，229.48 U/L，且LDH的釋放量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著升高(P<0.05)，說明隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞損傷程度逐漸加深(圖4)，同時(shí)表明大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的損傷是快速且持續(xù)的，因此選用MOI比值=4∶1建模最具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 LDH釋放量的變化Fig.4 Changes in LDH release

2.4 大腸桿菌感染細(xì)胞后細(xì)胞狀態(tài)

大腸桿菌感染細(xì)胞(MOI比值= 4∶1)后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。如圖 5 所示，大腸桿菌感染細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)逐漸消失，并產(chǎn)生圓形小泡，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，這一現(xiàn)象越來越明顯。

圖5 倒置顯微鏡觀察大腸桿菌感染成纖維細(xì)胞Fig.5 Inverted microscope observation of E.coli infected fibroblasts

2.5 caspase-3基因表達(dá)

大腸桿菌感染細(xì)胞后caspase-3mRNA表達(dá)情況如圖 6 所示。與對(duì)照組相比，大腸桿菌感染綿羊乳腺成細(xì)胞后1～5 h內(nèi)caspase-3mRNA表達(dá)量顯著增加至1.30～2.08倍(P<0.05)。

圖6 caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of caspase-3 mRNA

2.6 caspase-4，5酶活性變化

大腸桿菌感染細(xì)胞后caspase- 4，5酶活性變化如圖 7 所示。與對(duì)照組相比感染 1～3 h內(nèi)caspase-4活性逐漸上升，caspase-5活性顯著上升(P<0.05)；在感染時(shí)間超過3 h后，caspase-4活性逐漸下降(P>0.05)，caspase-5活性顯著下降(P<0.05)。

圖7 caspase-4，5酶活性變化Fig.7 caspase-4，5 enzyme activity change

2.7 CLI-095對(duì)細(xì)胞的毒性作用

CLI-095說明書指出阻斷劑孵育細(xì)胞 1 h即可達(dá)到阻斷TLR4表達(dá)的效果，因此，檢測(cè)2 h內(nèi)阻斷劑對(duì)細(xì)胞增殖率的影響足夠判斷本試驗(yàn)中阻斷劑對(duì)細(xì)胞有無毒性作用。試驗(yàn)結(jié)果見圖 8，阻斷劑作用細(xì)胞后 2 h內(nèi)ΔOD490顯著升高(P<0.05)，說明此時(shí)細(xì)胞活力仍正常，因此該抑制劑可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖8 CLI-095對(duì)細(xì)胞增殖率的影響Fig.8 Effect of CLI-095 on cell proliferation rate

2.8 TLR4 mRNA表達(dá)

大腸桿菌感染細(xì)胞后TLR4mRNA表達(dá)量如圖 9 所示。非阻斷組結(jié)果顯示細(xì)菌感染細(xì)胞1～2 h內(nèi)，TLR4mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，感染2 h后TLR4表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；阻斷組結(jié)果顯示，在細(xì)菌感染細(xì)胞1～3 h內(nèi)，TLR4mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，感染3 h后TLR4表達(dá)量下降但無明顯規(guī)律；阻斷組與非阻斷組對(duì)比可知，阻斷劑孵育細(xì)胞 1 h后，細(xì)菌感染細(xì)胞1～4 h內(nèi)對(duì)TLR4mRNA的表達(dá)均有顯著抑制效果(P<0.05)。

圖9 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of TLR4 mRNA

2.9 TLR4蛋白表達(dá)

大腸桿菌感染細(xì)胞后TLR4蛋白表達(dá)情況如圖 10，11 所示，TLR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量在大腸桿菌感染細(xì)胞1～2 h內(nèi)顯著升高(P<0.05)，2 h后逐漸下降(P<0.05或P>0.05)。

圖10 TLR4蛋白表達(dá)Fig.10 TLR4 protein expression

圖11 TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Relative expression of TLR4 protein

2.10 細(xì)菌黏附數(shù)測(cè)定

平板活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表 3，非阻斷組的大腸桿菌黏附數(shù)為(40.3×106)cfu/mL，阻斷組的大腸桿菌黏附數(shù)為 (33.0×106)cfu/mL；TLR4阻斷劑CLI-095處理細(xì)胞后，細(xì)菌的黏附力有所下降，計(jì)算得出細(xì)菌黏附阻斷率為18.32% 。

表3 細(xì)菌黏附數(shù)及黏附阻斷率Tab.3 Bacterial adhesion number and adhesion blocking rate

3 討論

目前乳腺細(xì)胞已被用來研究哺乳動(dòng)物乳腺生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳機(jī)理、乳腺疾病的理想模型[19]，Kandasamy等[20]利用體外培養(yǎng)獲得奶牛乳腺成纖維細(xì)胞，大腸桿菌LPS感染后分析了細(xì)胞基因組的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組IL-8、TNF-α基因表達(dá)存在顯著性差異；Kandasamy 等[21]利用大腸桿菌LPS人工感染奶牛乳腺成纖維細(xì)胞建立大腸桿菌性乳腺炎細(xì)胞模型，從43頭泌乳早期的奶牛中分離得到乳腺成纖維細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)LPS感染后將各組IL-8蛋白的產(chǎn)生量進(jìn)行了分析排序，結(jié)果顯示，未感染LPS的細(xì)胞不分泌IL-8，LPS處理后的細(xì)胞在IL-8表達(dá)的變化量高達(dá)7倍左右；Benjamin等[22]利用金黃色葡萄球菌感染奶牛乳腺成纖維細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的反應(yīng)性將奶牛分為低反應(yīng)型和高反應(yīng)型，結(jié)果表明，乳腺成纖維細(xì)胞可作為進(jìn)一步研究動(dòng)物對(duì)乳腺感染反應(yīng)差異的參考模型，這些研究發(fā)現(xiàn)都預(yù)示著乳腺成纖維細(xì)胞的免疫機(jī)制在乳腺炎防治中有著重要意義。本試驗(yàn)采用透明質(zhì)酸酶結(jié)合Ι型膠原酶的酶消化法分離并獲得乳腺成纖維細(xì)胞，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

LDH主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞受損后細(xì)胞膜破裂，LDH釋放至胞外，故細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活力是反映細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。Wellnitz等[23]為了研究體細(xì)胞SCC數(shù)和LDH活性在脂多糖(LPS)大腸桿菌性乳腺炎中的情況，發(fā)現(xiàn)LPS刺激可使牛奶SCC升高，且牛奶中LDH活性隨著LPS的刺激而增加；SCC數(shù)升高和LDH活性增加反映了乳腺受損嚴(yán)重、機(jī)體免疫效率降低，這可能是由于細(xì)胞受損后無法參與產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，同時(shí)說明乳腺細(xì)胞與乳腺組織的免疫功能密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)大腸桿菌感染細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著上升，說明細(xì)胞受損隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步加強(qiáng)；大腸桿菌感染細(xì)胞3 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量即達(dá)到188 U/L，這與王胤杰[24]在研究金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞LDH影響的結(jié)果相比，金葡菌在感染細(xì)胞8 h后才達(dá)到這一水平，這也說明大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的損傷更為迅速，同時(shí)驗(yàn)證了大腸桿菌性乳腺炎具有急性這一特點(diǎn)[25-27]。Caspase是一類蛋白酶，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)不同的亞型，caspase-3位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，在細(xì)胞凋亡中占據(jù)主導(dǎo)位置[28]，caspase-3作為凋亡反應(yīng)的效應(yīng)子，其mRNA的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性現(xiàn)象；caspase-4，5為炎性半胱天冬酶，在細(xì)胞焦亡中主要通過炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生理功能。大腸桿菌感染后caspase-3、caspase-4、caspase-5表達(dá)均顯著性升高(P<0.05)；這反映大腸桿菌通過活化caspase-3來執(zhí)行細(xì)胞凋亡信號(hào)，通過激活caspase-4，5誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡；崔新潔[29]在用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)現(xiàn)，凋亡過程中caspase-3基因表達(dá)顯著性升高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。目前細(xì)胞焦亡在人及小鼠的研究中較為廣泛，在綿羊乳腺炎中報(bào)道甚少。大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌，引起細(xì)胞焦亡的主要效應(yīng)因子是caspase-4、caspase-5、caspase-11，本試驗(yàn)結(jié)果顯示在大腸桿菌性乳腺炎中caspase-4、caspase-5酶活性變化百分比均存在顯著性升高。

TLR4是細(xì)胞膜表面的受體，同時(shí)也是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的特異性受體。本試驗(yàn)結(jié)果表明,TLR4在感染大腸桿菌的綿羊成纖維細(xì)胞中基因和蛋白水平的表達(dá)均明顯上升，說明TLR4在大腸桿菌性乳腺炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了一定的作用。目前，關(guān)于TLR4與綿羊乳腺炎的相關(guān)報(bào)道甚少，Goldammer等[11]為了分析先天性免疫應(yīng)答在抵抗乳腺感染中的作用，測(cè)定了健康和受感染的乳腺組織中TLR9、TLR2、TLR4、BNBD5mRNA的豐度，試驗(yàn)結(jié)果表明，除TLR9外，其他基因在受感染組織中的mRNA豐度均顯著增加(4～13倍)，這也表明TLR4在抵御乳腺炎中起著重要作用。Pandey等[30]、Werner-Misof等[31]研究了不同劑量大腸桿菌脂多糖在乳腺內(nèi)部灌注時(shí)乳腺細(xì)胞的免疫反應(yīng)和乳腺緊密連接的狀態(tài)，結(jié)果顯示，隨著LPS劑量的升高，乳腺蛋白質(zhì)斑塊密度降低、TLR4mRNA表達(dá)顯著增加，這些特點(diǎn)在Schmitz等[32]、Prgomet等[33]的研究中均有體現(xiàn)。

細(xì)菌的黏附力及侵襲力是衡量細(xì)菌致病力的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷劑可以降低細(xì)胞中TLR4的表達(dá)及E.coli的黏附力。Gonen等[34]利用小鼠乳腺炎作為模型來研究乳腺的先天炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)將LPS輸注在野生型小鼠中可誘發(fā)乳腺炎，但在表達(dá)突變TLR4的小鼠中不誘導(dǎo)乳腺炎；將TLR4表達(dá)的巨噬細(xì)胞移入小鼠肺泡乳腔，小鼠恢復(fù)野生型表型。此外，在缺乏功能性TLR4的情況下，細(xì)菌高效入侵并感染上皮細(xì)胞后形成胞內(nèi)微菌落；并且TLR4表達(dá)的巨噬細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移大大減少了細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲。Wang等[35]在小鼠慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)感染模型中，發(fā)現(xiàn)TLR4通過亞致死劑量的LPS和PD-1阻斷劑觸發(fā)后，可以顯著改善循環(huán)中病毒特異性CD8 T細(xì)胞的反應(yīng)，結(jié)果反映了TLR4阻斷劑可通過對(duì)LPS的作用顯著改善病毒細(xì)胞的反應(yīng)，這可能對(duì)開發(fā)針對(duì)慢性病毒感染的新型檢查點(diǎn)療法具有重要意義。本試驗(yàn)可能是由于CLI-095抑制了大腸桿菌LPS與細(xì)胞表面TLR4的特異性結(jié)合，從而降低了細(xì)菌的黏附力，減弱了細(xì)菌的致病力，試驗(yàn)結(jié)果可為大腸桿菌性乳腺炎的防治提供理論基礎(chǔ)。