駱延波　張印　胡明　李璐璐　張慶　趙效南　齊靜　陳義寶　許曉暉　劉玉慶

摘 要：將1日齡健康雛雞80只，隨機(jī)分為四組，每組20只。其中1～3組為試驗(yàn)組，分別在飲水中全程添加推薦劑量1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（20 g/L）的扶正解毒顆粒;4組為不用藥對(duì)照組。試驗(yàn)期8周，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，每周末稱重1次，8周末試驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟采血測(cè)定各組雞的血液生理生化指標(biāo)，剖檢雞只，通過(guò)組織切片觀察各臟器有無(wú)變化。從試驗(yàn)組2（即3倍推薦用藥劑量組）和不用藥對(duì)照組雞只腸道中采集內(nèi)容物分離大腸桿菌，進(jìn)行抗藥性分析。結(jié)果顯示，各組試驗(yàn)雞的行為、采食、糞便性狀與空白對(duì)照組相比，均未見(jiàn)異常變化。1倍劑量組和3倍劑量組試驗(yàn)雞的體重均顯著高于不用藥對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）和5倍劑量組（P<0.05或P<0.01）;而1倍劑量組和3倍劑量組間在各日齡段均無(wú)顯著差異（P>0.05）。試驗(yàn)各組和不用藥對(duì)照組雞只血液生理生化指標(biāo)紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞比例均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。試驗(yàn)各組臟器顏色、形狀、大小、位置等均未見(jiàn)異常變化。顯微鏡觀察組織切片，細(xì)胞符合正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。大腸桿菌對(duì)8種藥物的MIC值均未有顯著差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，扶正解毒顆粒對(duì)靶動(dòng)物雞無(wú)明顯不良影響，對(duì)大腸桿菌抗藥性水平影響不顯著。

關(guān)鍵詞：扶正解毒顆粒;雞;血液;生理指標(biāo);大腸桿菌;抗藥性

中圖分類號(hào)：S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2022）04-0012-07

扶正解毒顆粒是由《中國(guó)獸藥典·二部》（2015版）中的扶正解毒散經(jīng)過(guò)劑型改造而制成。按照農(nóng)業(yè)部442號(hào)公告發(fā)布的《中獸藥、天然藥物分類及注冊(cè)資料要求》屬于申報(bào)四類傳統(tǒng)中獸藥復(fù)方制劑。扶正解毒散具有扶正祛邪、清熱解毒之功效，臨床上用于雞傳染性法氏囊病的治療[1-2]。經(jīng)過(guò)劑型改造后，本制劑在臨床上主要用于提高雞的免疫力，與疫苗協(xié)同使用提高疫苗抗體水平，并延長(zhǎng)抗體在禽類體內(nèi)的持續(xù)作用時(shí)間。為了全面評(píng)價(jià)本制劑在臨床上的確切功效，本試驗(yàn)首先通過(guò)靶動(dòng)物安全試驗(yàn)考察受試獸藥扶正解毒顆粒用于靶動(dòng)物雞的的安全性及安全劑量范圍，為臨床試驗(yàn)給藥方案的制定提供依據(jù)。隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素使用量劇增，在一定程度上造成細(xì)菌抗藥性程度較高，急需細(xì)菌抗藥性防控技術(shù)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)，添加中藥在一定程度上減緩細(xì)菌抗藥性的增加速度，或部分消除抗藥性[8-10]。因此，本研究通過(guò)添加扶正解毒顆粒觀察是否對(duì)大腸桿菌抗藥性產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料 1日齡體重相差±5 g的海蘭灰蛋雞雛：購(gòu)自保定市潯源禽業(yè)有限公司，嚴(yán)格按照管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。飼料：市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)雛雞全價(jià)飼料。

1.1.2 供試藥品及試劑 扶正解毒顆粒：山東明發(fā)獸藥股份有限公司提供，規(guī)格：100 g/袋，含量：1 g，相當(dāng)于原生藥0.5 g。批號(hào)：20170901。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 OLYMPUS生物顯微鏡：日本制造。全自動(dòng)生化分析儀：日本東芝TBA-120FR。電子天平：Precisa 92SM-202A。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與處理 根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中對(duì)靶動(dòng)物安全試驗(yàn)的分組要求，從新購(gòu)進(jìn)的1日齡雛雞中選取體重相近、健康活潑的雛雞80只，隨機(jī)分為4組，每組20只。其中1～3組為試驗(yàn)組，分別在飲水中全程添加推薦劑量1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（2 0g/L）的扶正解毒顆粒;4組為不用藥對(duì)照組，全程飲用新鮮自來(lái)水。試驗(yàn)期8周，每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，每周末稱重1次，8周末試驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟采血測(cè)定各組雞的血液生理生化指標(biāo);同時(shí)進(jìn)行剖檢，通過(guò)組織切片觀察各臟器有無(wú)變化。在試驗(yàn)開(kāi)始前以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從試驗(yàn)組2（即3倍推薦用藥劑量組）和空白對(duì)照且雞只腸道中采集內(nèi)容物分離大腸桿菌，并進(jìn)行抗藥性分析。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法[11-14] 紅細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定：采用試管法，即將供檢血稀釋200倍后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)一定容積內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算出每升血液中的紅細(xì)胞數(shù)。紅細(xì)胞總數(shù)的計(jì)算公式：紅細(xì)胞總數(shù)（×10¹²個(gè)/L） = X×10 000。式中的X為5個(gè)中方格的紅細(xì)胞總數(shù)。

白細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定：采用試管法，即將供檢血稀釋20倍后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)一定容積內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算出每升血液中的白細(xì)胞數(shù)。白細(xì)胞總數(shù)的計(jì)算公式：白細(xì)胞總數(shù)（×10⁹個(gè)/L） = X×50×10⁶。式中的X為4個(gè)大方格中的白細(xì)胞總數(shù)。

淋巴細(xì)胞比例的測(cè)定：用未抗凝血，制作血涂片，姬姆薩染色法染色，采用白細(xì)胞分類法對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞比例。

血紅蛋白含量的測(cè)定：采用比色法。紅細(xì)胞遇酸溶解后會(huì)游離出血紅蛋白，并被酸化為褐色的酸性血紅素，稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)比色柱比色，即可求得血紅蛋白的含量。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）值測(cè)定：根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 建立的標(biāo)準(zhǔn)藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法[15]，測(cè)定多黏菌素、多西環(huán)素、頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林和新霉素等8種抗生素對(duì)這些分離菌株的抗藥性水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 扶正解毒顆粒對(duì)雞臨床體征的影響

在試驗(yàn)過(guò)程中每天觀察并記錄各組雞的臨床體征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組試驗(yàn)雞的行為、采食、糞便性狀與空白對(duì)照組相比， 均未見(jiàn)異常變化。說(shuō)明扶正解毒顆粒對(duì)靶動(dòng)物雞的狀況無(wú)明顯不良影響。

2.2 扶正解毒顆粒對(duì)雞體重的影響

在試驗(yàn)期間每周對(duì)各組試驗(yàn)雞稱體重1次， 通過(guò)計(jì)算每個(gè)周末試驗(yàn)雞的平均體重可知，受試雞在試驗(yàn)期前2周內(nèi)各組間的平均體重均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。從21日齡開(kāi)始到試驗(yàn)結(jié)束，1倍劑量組和3倍劑量組試驗(yàn)雞的體重均顯著高于不用藥對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）;從28日齡開(kāi)始到試驗(yàn)結(jié)束，1倍劑量組和3倍劑量組試驗(yàn)雞的體重均顯著高于5倍劑量組（P<0.05或P<0.01）;而1倍劑量組和3倍劑量組間在各日齡段均無(wú)顯著差異（P>0.05）。5倍劑量組和對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 扶正解毒顆粒液對(duì)雞血液生理指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，從1～56日齡在試驗(yàn)雞飲水中全程添加推薦劑量1倍、3倍、5倍的扶正解毒顆粒，其血液生理指標(biāo)紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞數(shù)以及淋巴細(xì)胞比例均與不用藥對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），且3個(gè)用藥劑量組間也均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.4 病理學(xué)檢查結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)各組雛雞剖檢，進(jìn)行肉眼病理學(xué)觀察。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，各組臟器顏色、形狀、大小、位置等均未見(jiàn)異常變化。

顯微鏡觀察組織切片，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓完整，排列有序;胞質(zhì)豐滿，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，符合正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?？梢哉J(rèn)定藥物對(duì)所采集組織無(wú)毒性作用（圖1～4）。

2.5 大腸桿菌抗藥性結(jié)果

2.5.1 分離鑒定細(xì)菌 在試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從3倍推薦劑量組和空白對(duì)照組分別分離到大腸桿菌各20株。編號(hào)分別為試驗(yàn)1～20號(hào)，對(duì)照1～20號(hào)。

2.5.2 細(xì)菌抗藥性檢測(cè)結(jié)果 8種抗生素對(duì)分離菌株大腸桿菌的MIC值對(duì)比見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出，3倍推薦劑量試驗(yàn)組中雞源大腸桿菌對(duì)多黏菌素、多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻呋、氧氟沙星抗藥性水平基本上沒(méi)變化，而對(duì)氨芐西林、慶大霉素、新霉素的抗藥性水平略有下降，但不顯著（P>0.05）。

3 討論

《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010版）中收錄的扶正解毒散，方中的黃芪有提升免疫力的作用[17-19]，淫羊藿有滋補(bǔ)腎陽(yáng)氣功效[16]，二者配合使用具有明顯的提升免疫力的能力;板藍(lán)根內(nèi)含有多種抗病毒物質(zhì)，具有良好的清熱解毒、降火功能，可單獨(dú)使用，也可與其它藥配伍使用，對(duì)多種病毒引起的疾病都有較好效果。三味藥相互組合，在提升免疫力的基礎(chǔ)上清熱解毒，降低了細(xì)菌性疾病和病毒性疾病感染的機(jī)會(huì)。

本試驗(yàn)以臨床推薦劑量的1倍（4 g/L）、3倍（12 g/L）和5倍（20 g/L）在試驗(yàn)雞飼養(yǎng)的56 d中，全程在飲水中添加扶正解毒顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各用藥組試驗(yàn)雞的外在表現(xiàn)、采食、糞便性狀與空白對(duì)照組相比， 均未見(jiàn)異常變化;各用藥組試驗(yàn)雞的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞數(shù)以及淋巴細(xì)胞比例均與不用藥對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）;組織學(xué)觀察心肝脾腎也均未見(jiàn)異常。表明扶正解毒顆粒對(duì)試驗(yàn)雞無(wú)不良影響。

試驗(yàn)過(guò)程中，從21日齡開(kāi)始，1倍劑量組和3倍劑量組試驗(yàn)雞的體重均顯著高于不用藥對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。這種結(jié)果的出現(xiàn)，不是受試藥品不良反應(yīng)的表現(xiàn)，而是由于組方中補(bǔ)氣健脾的黃芪增加了雞群脾胃的運(yùn)化和吸收功能[16]，從而導(dǎo)致其體重比不用藥對(duì)照組顯著增加。

本試驗(yàn)結(jié)果中1倍劑量組和3倍劑量組試驗(yàn)雞的體重較不用藥對(duì)照組顯著增加（P<0.05或P<0.01），而5倍劑量組卻與對(duì)照組雞的體重?zé)o顯著性差異（P> 0.05），從另一個(gè)角度進(jìn)一步證明了實(shí)驗(yàn)室臨床試驗(yàn)所推薦的4 g/L飲水劑量的合理性。這主要是因?yàn)樵S多中藥的藥效與用藥劑量呈鐘罩狀關(guān)系，即在一定劑量范圍內(nèi)藥效隨著劑量的增加而顯著增大，當(dāng)用藥劑量達(dá)到某一定范圍時(shí)，藥效不再隨著用藥劑量的增加而增大;當(dāng)用藥劑量超過(guò)一定范圍后，藥物的藥效隨著劑量增加反而降低。本試驗(yàn)結(jié)果中，1倍和3倍劑量可顯著提高試驗(yàn)雞的體重，而5倍劑量卻沒(méi)有明顯作用，就屬這種情況。

本試驗(yàn)添加扶正解毒顆粒，對(duì)于雞腸道大腸桿菌的抗藥性水平影響不明顯，可能與中藥的成分和使用時(shí)間較短有關(guān)系。盡管扶正解毒顆粒對(duì)于大腸桿菌的抗藥性影響很小，但可通過(guò)提高雞體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體抗菌抗病毒的能力，提高生產(chǎn)性能。隨著抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致嚴(yán)重的多重抗藥性和藥物殘留，以至于歐盟以及我國(guó)出臺(tái)了相關(guān)法規(guī)政策禁止飼料中添加任何抗生素促生長(zhǎng)劑，全球范圍內(nèi)抗生素的從嚴(yán)處方化管理和抗藥性監(jiān)測(cè)漸成常規(guī)[20-21]，因此具有免疫功能的扶正解毒顆粒能夠抗藥抗病毒，是一種很好的抗生素替代產(chǎn)品。

4 結(jié)論

靶動(dòng)物安全試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在飲水中添加3倍和5倍推薦劑量的受試藥品扶正解毒顆粒對(duì)靶動(dòng)物雞仍無(wú)明顯不良影響。

3倍推薦劑量的受試藥品扶正解毒顆粒在8周作用時(shí)間下其對(duì)8種藥物的抗藥性水平未發(fā)生顯著變化。

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Study on Toxicity of Fuzheng Jiedu Granules to Chickens and

to drug Resistance of Escherichia coli

LUO Yanbo， ZHANG Yin，HU Ming，LI Lulu ， ZHANG Qing，ZHAO Xiaonan，

QI Jing ，CHEN Yibao，XU Xiaohui，LIU Yuqing

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Animal breeding and diseases Control， Shandong Jinan? 250100 China）

Abstract： 80 healthy 1-day-old chicks were randomly divided into four groups， with 20 chickens in each group. Among them， 1-3 groups are the experimental group， and Fuzheng Jiedu granules with the recommended dose of 1 times （4 g/L）， 3 times （12 g/L） and 5 times （20 g/L） are added to the drinking water respectively，but the drug is not added in group 4. Control group. During the 8-week test period， the clinical signs of each group of chickens are observed and recorded and chickens are weighed? once every weekend.At the end of the 8-week，blood are collected to determine the blood physiological and biochemical indicators of each group of chickens. Microscopic observation of tissue sections also will be done.At the same time，Escherichia coli was isolated from the intestinal tract of chickens in experimental group 2 （that is， three times the recommended dosage） for drug resistance analysis. The results showed that the behavior， feeding， and fecal traits of the test chickens in each group showed no abnormal changes compared with the blank control group. The body weight of the test chickens in the? group 1and the group 3? was significantly higher than that in the control group （P <0.05 or P <0.01） and the 5-dose group （P <0.05 or P <0.01）; while there was no significant difference between the group 1 and group 3（P> 0.05）. The blood physiological and biochemical indexes of red blood cells， hemoglobin， white blood cells and lymphocyte ratio were not significantly different in the chickens of each experimental group and the drug-free control group （P> 0.05）. There were no abnormal changes in the color， shape， size and position of organs in each group. Microscopic observation of tissue sections， cells conform to normal tissue morphology and structural characteristics. There was no significant difference in the MIC values of E. coli against the eight drugs （P> 0.05）. The above results indicate that Fuzheng Jiedu Granules have no obvious adverse effects on the chickens， and have no significant effect on the level of E. coli resistance.

Keywords： Fuzheng Jiedu Granules; Chicken; Blood; Physiological indexes; E. coli; Drug resistance