鄭涵奇，吳晴，李洪軍，2，顧臻，2，3，4

（1 浙江省先進遞藥系統(tǒng)重點實驗室，浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058；2 浙江省系統(tǒng)與精準醫(yī)學實驗室，良渚實驗室，浙江大學醫(yī)學中心，浙江 杭州 311121；3 浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院，普外科，浙江 杭州 310016；4 高分子合成與功能化教育部重點實驗室，浙江大學高分子科學與工程系，浙江 杭州 310027）

Representative examples for the integration of synthetic biology and nanobiotechnology.Nanotechnology can reinforce the development of synthetic biology by promoting the design and delivery of gene circuits.The delivery of gene circuits can be facilitated by nanocarriers, including organic (a),inorganic(b),and bionic(c)systems.Nanoparticles can convert optical,magnetic,and acoustic signals to thermal signals to regulate gene expression(d).Synthetic biology can extend the applications of nanotechnology through genetically engineering biologic nano-agents.Platelets (e), exosomes(f), microvesicles (g), and membrane-derived vesicles (h) can be programmed through synthetic biology.Synthetic biology and nanobiology can jointly generate functional modules and hybrid systems for artificial biomimetic systems.DNA, lipids, and polymers can self-assemble into functional modules(i),and nanoparticles can be combined with chimeric antigen receptor T-cells and bacteria respectively to form hybrid systems(j).

合成生物學技術通過對生命體進行工程化的設計、改造乃至重新合成，最終創(chuàng)建超越自然功能的人造系統(tǒng)［1］。合成生物學技術已在多個領域產生了重要的影響并實現(xiàn)了應用，包括生命健康、生物醫(yī)藥、農業(yè)生產、新型化工、污染治理等領域。合成生物學的研究主要有兩種理念的指導：“自上而下”理念是使用代謝或基因工程技術賦予現(xiàn)有生物系統(tǒng)新的功能；“自下而上”理念是以非生命的生物分子組件來從頭設計并創(chuàng)建新的生物系統(tǒng)［2］。從“自上而下”的策略出發(fā)，合成生物學將復雜的天然生命系統(tǒng)抽象化、解偶聯(lián)，拆解為標準化的生物元件［3］。通過生物元件的功能化組裝，重構為復雜的基因線路以編碼細胞的功能，使得合成的生命系統(tǒng)達到預定的目標［4］。目前開發(fā)出的鋅指蛋白（zinc-finger proteins，ZFPs）、轉錄激活因子樣效應器（transcription activator-like effectors，TALEs）和聚集的規(guī)則間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）等技術，可以用來構建和調控合成基因線路［5］。然而，合成基因線路如何安全高效地遞送到特定靶部位、導入特定的細胞是合成生物學研究向臨床轉化的重要挑戰(zhàn)［6］。

納米生物學技術旨在利用物質在微納米尺度下具有的獨特的物理、化學和生物性質以解決藥物遞送、疾病診斷和干預等重大生物學問題［7-8］。納米材料可以通過封裝或附著等多種方式［9］，幫助以基因線路為代表的合成生物學元件跨越多重生理屏障有效到達靶標位置。同時納米材料所具有的獨特的化學、機械、磁、電和生物特性［10］，能夠實現(xiàn)對信號的響應以達到體內外行為的可控。然而，傳統(tǒng)的納米材料生產主要基于物理、化學方法進行，且常使用的溶劑和修飾分子往往帶來生物安全性方面的隱患［11］。近年來，以生物為中心的納米材料生產展現(xiàn)出環(huán)保、生物活性好、毒性相對較小的優(yōu)勢。除了采用基因工程生物如轉基因菌株、酵母、煙草花葉病毒等作為生物工廠合成納米材料［12］之外，以細胞為來源衍生出的納米囊泡、納米顆粒生物相容性高，也被廣泛用于新型納米制劑的研發(fā)［13］。生物源性納米材料在基因工程的助力下可以被自主設計和改造［14］，為其生物應用帶來突破。

鑒于合成生物學和納米生物學各自的特色與需求，兩者的融合是學科發(fā)展的一大趨勢。自然界中許多復雜的生物功能由自組裝功能單元的共價或低聚組合進化而來。相應地，基于合成生物學“自下而上”的理念，從盡可能小的組分（包括DNA、蛋白質和其他有機分子等）出發(fā)，可以構筑全新的生物功能組件模塊，從而創(chuàng)建完全可操作的生物系統(tǒng)［15］。同時，自下而上的自組裝方法也是納米生物學中的重要技術手段［16］，可以在納米尺度上創(chuàng)造新的器件，模擬或強化生命體的特定功能。因此，在合成生物學策略指導下，通過自組裝方式獲得具有生物催化或觸發(fā)響應功能的模塊化納米組件，實現(xiàn)對酶促反應隔室化和外界刺激響應性等活細胞特征的仿生，可為人造細胞的構建提供新的設計思路［17］。此外，將納米器件和合成生物學改造后的底盤生物（如嵌合抗原受體T細胞、工程化細菌等）結合形成的納米人工雜合系統(tǒng)，可以發(fā)揮雙重功效，實現(xiàn)生物學功能的進一步優(yōu)化和可調控。

綜上，本文討論了合成生物學和納米生物學的交叉融合以及在生物醫(yī)藥領域中的近期實踐。一方面，兩者可以互相借鑒對方學科的特色，以促進自身突破性發(fā)展：①納米技術可以助力應對合成生物學發(fā)展中的一些挑戰(zhàn)，利用納米載體能靶向性地遞送基因線路和基因編輯體系，也可以實現(xiàn)用外部物理刺激來啟動基因開關；②合成生物學基因編輯手段可以改進生物源性納米制劑的性能，擴展細胞膜囊泡和工程化細胞的應用場景。另一方面，合成生物學和納米生物學的融合可以拓展研發(fā)思路：①以“自下而上”的理念為指導，以核酸、蛋白質、無機材料、有機聚合物等為材料，構筑出模塊化的納米級功能組件，來模擬細胞功能；②將納米功能元件整合到合成底盤生物模塊中，構建納米人工雜合生物系統(tǒng)，結合兩個學科的優(yōu)勢，為腫瘤等重大疾病的治療和診斷提出新的策略。

1 納米技術為合成生物學的發(fā)展賦能

1.1 納米技術助力基因線路與基因編輯體系遞送

病毒載體已經被廣泛應用于遞送基因線路和CRISPR/Cas9等基因編輯系統(tǒng)，包括腺相關病毒載體（adeno-associated virus， AAV）［18-21］、腺 病 毒 載 體（adenovirus，AV）［22］和慢病毒載體（lentivirus，LV）［23］等。AAV 所 能 包 封 的 基 因 容 量 有 限（約4.5 kb）；LV 雖然包封基因的容量較大，但易整合到宿主細胞基因組，可能誘導插入突變；AV 不整合入基因組，但有高免疫原性［24］。病毒載體安全性方面的不確定性制約了其在基因工程中的推廣應用，鑒于此，非病毒載體近年來引起了越來越多的關注。

納米技術的進步，為實現(xiàn)基因線路和基因編輯系統(tǒng)的多樣化、靶向性遞送和可控性釋放提供更多的選擇。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送包括三種策略：遞 送CRISPR/Cas9 的 質 粒［25］，遞 送Cas9 mRNA-sgRNA［26］，以及直接打包遞送sgRNA 和Cas9 蛋白［27-28］。非病毒的合成納米載體不僅可以幫助帶負電的質粒DNA、RNA 進入細胞，也使攜帶Cas9等蛋白［29］穿過細胞膜成為可能。

目前已研發(fā)出的靶向遞送基因和基因編輯系統(tǒng)的納米載體種類涵蓋了有機載體、無機載體和生物仿生載體等新型功能化納米載體。

1.1.1 有機納米載體

脂質體、脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）等已經被廣泛用作載體來遞送mRNA［30-31］和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。由于核酸攜帶有高密度的負電荷，陽離子脂質體是一種常見的非病毒基因遞送載體［32］。雖然Cas9 蛋白是正電性的，不能直接通過靜電相互作用和陽離子脂質體結合，但Cas9/sgRNA 核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）是負電性的［33］，可以用陽離子脂質體裝載遞送Cas9-sgRNA RNP［34］?；诼蚜字?5］等兩性離子脂質［36］、可電離脂質［37-38］的載體也被用于遞送CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，促進細胞內涵體逃逸。然而，基因組編輯蛋白的不穩(wěn)定性、較差的膜滲透性和從內涵體中釋放的低效率［39］，都對納米遞送載體提出新的要求。對脂質進行功能化修飾有望提供幫助。比如已經報道的含有二硫鍵的生物可還原脂質納米顆粒［40-41］可響應還原性細胞內環(huán)境，增加內涵體逃逸，實現(xiàn)mRNA 和Cas9/sgRNA RNP的高效遞送。轉鐵蛋白修飾的脂質體結合了腫瘤靶向潛力和優(yōu)異的基因遞送性能，進一步拓寬了靶向基因治療的潛力［42］。

傳統(tǒng)的LNPs 由可電離的陽離子脂質、兩親性磷脂、膽固醇和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-脂質組成［43］，改變調節(jié)脂質成分，有望實現(xiàn)選擇性器官靶向（selective organ targeting，SORT）策略。通過加入不同物質的量的SORT 脂質（永久陽離子、陰離子、兩性離子和可電離的陽離子等），可以實現(xiàn)基因和編輯體系的組織特異性遞送（如肺、脾和肝臟靶向）和多樣性遞送（包括mRNA、Cas9 mRNA/sgRNA 和Cas9 RNP 復合物等形式）［43］［圖1（b）］。

圖1 納米技術助力基因線路與基因編輯體系遞送Fig.1 Nanotechnology enhances the delivery of gene circuits and gene editing agents

高分子聚合物是另一類常用的基因遞送納米載體。許多陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）［44］、聚賴氨酸［45-46］、聚胺樹枝狀聚合物［47］、聚（β-氨基酯）［48］、聚［2-（二異丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯］［49］、聚環(huán)氧丙烷［50］、氟化酸不穩(wěn)定支鏈富羥基聚陽離子［51］、乳糖衍生的支鏈陽離子生物聚合物［52］等都用作CRISPR 系統(tǒng)的納米遞送載體。對聚合物進行修飾和組合有助于提高遞送性能。基于陽離子α-螺旋多肽的聚乙二醇化納米顆粒具有較高的膜穿透能力［53］；由含有二亞乙基三胺部分的單體和含有胍基配體的單體共聚得到的聚（二硫化物）可遞送不同形式的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實現(xiàn)遞送目標的高效釋放，并且能生物降解，減少細胞毒性［54］；門控式的嵌段共聚物囊泡也展現(xiàn)出了出色的遞送效率和觸發(fā)響應性釋放性能［55］。針對惡性腫瘤的標志物基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2， MMP-2），也開發(fā)出了由MMP-2 底物、細胞穿透肽和外層PEG 功能化的聚合物納米顆粒和膠束，它們在腫瘤部位積累后，由腫瘤過表達的MMP-2 觸發(fā)降解含MMP-2 底物的外殼，暴露出細胞穿透肽，提高質粒［56］、CRISPR/dCas9［57］和siRNA［58］的腫瘤轉染效率。此外，Chen等［59］還開發(fā)出具有核殼納米結構、脂質體模板化的水凝膠納米粒子，Li 等［60］用氟化聚合物開發(fā)出多功能、核靶向的核殼結構人工病毒用于基因編輯系統(tǒng)遞送。

相較于其他納米載體，有機納米載體走在了臨床轉化的前列，但也面臨一些挑戰(zhàn)，比如，與其他載體類似，一些載體中攜帶的正電荷會引起細胞毒性和“蛋白冠”的形成，使得體內清除加快［61］。其在體內的生物學命運也亟待進一步探究和優(yōu)化［62］。

1.1.2 無機納米載體

金納米粒（gold nanoparticles， GNPs）具有制備可控、易功能化以及較好的生物安全性特征［63］，是基因線路和基因編輯系統(tǒng)的一種潛在的遞送平臺。金納米粒、金納米團簇［64］可以將Cas9蛋白-sgRNA 共同遞送到胞內［65-67］，具有雙鏈DNA支架和MMP-2可切割肽修飾的金納米籠［68］也可以將siRNA 和化療藥聯(lián)合靶向遞送。Shahbazi 等［69］開發(fā)的一種基于膠體金納米粒子的CRISPR 納米制劑，封裝了所有需要的基因編輯組件，可進行同源定向修復，有望成為不同細胞或組織中的有效遞送載體。

金納米粒子獨特的光熱轉換性能，使其能夠響應外界刺激，用于基因的可控釋放。Wang 等［70］報道一種遞送Cas9-sgRNA質粒的脂質-金納米顆粒載體。在激光照射下，金納米粒產生光熱效應，觸發(fā)釋放細胞穿膜肽（TAT肽）及其上面靜電吸附的質粒，并且TAT 肽-質粒復合物具有進入細胞核編輯目標基因的能力，從而實現(xiàn)激光控制的質粒靶向遞送。鑭系元素摻雜的上轉換納米粒子（upconversion nanoparticles， UCNPs）也被開發(fā)為光響應的Cas9 RNP 復合物觸發(fā)遞送平臺。UCNPs作為納米傳感器，可以將近紅外（near-infrared，NIR）光轉換為紫外光，用于光敏分子的裂解，從而可控釋放CRISPR/Cas9［71］［圖1（c）］。

自組裝納米級金屬-有機框架（metal organic frameworks，MOFs）作為一類新型的藥物遞送系統(tǒng)，可以封裝并遞送基因［72］和CRISPR/Cas9系統(tǒng)［73］。沸石咪唑骨架（zeolitic imidazolate frameworks， ZIFs）具有多孔結構，可實現(xiàn)胞內遞送核酸和蛋白質，其通過功能化修飾能進一步實現(xiàn)Cas9-sgRNA RNP的pH 響應性［74-75］和ATP 響應性［76］釋放。其他無機材料，如石墨烯氧化物［77］、介孔二氧化硅顆粒［78-79］、黑磷納米片［80］、磷酸鈣［81］等也可介導Cas9 RNP的遞送。

通常，這些無機材料納米粒子化學穩(wěn)定性好，但在肝臟和腎臟中易積累，在體內難以降解［82］，它們的臨床應用因而往往受到毒性和殘留物評價方面的挑戰(zhàn)［83］。

1.1.3 生物仿生納米載體

生物仿生納米材料具有較好的生物相容性，同時具有獨特的生物學功能，也被開發(fā)為基因線路等合成生物學元件的遞送系統(tǒng)。

天然膜衍生的納米囊泡［84］、細胞外囊泡［85-86］、DNA 納米線球［28］、病毒樣顆粒［87-88］等功能化的生物仿生材料可用于基因及編輯系統(tǒng)的靶向遞送。超聲處理間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）得到的納米囊泡［84］保留了MSCs對多種腫瘤細胞的表面相關靶向能力，將編碼治療基因的質粒cDNA有效地靶向并且轉染多種癌細胞，顯著延長了荷瘤小鼠的生存期。細胞外囊泡（外泌體和微泡）及其經過嵌合抗原受體修飾、雜合處理等方法改造得到的載體也被用于siRNA［86，89］和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)（質粒、sgRNA+dCas9 表達載體、RNP）［85，90-92］的遞送。

自組裝的DNA 納米結構具有生物相容性高、易于設計等特性。Zhuang 等［93］設計了連接有DNA 適配體的四面體DNA 納米結構（tetrahedral DNA nanostructures， TDNs），將TDNs 修飾到細胞外囊泡表面，實現(xiàn)Cas9 RNP 特異性靶向癌細胞。Han 等［82］直接用DNA 四面體 納米籠 實 現(xiàn)siRNA 的遞送。Ren 等［94］設計一種自組裝寡核苷酸納米載體裝載siRNA 作為“鑰匙”，同時引入兩種與細胞表面受體結合的適配體作為“雙鎖”，介導siRNA 精確遞送到特定靶細胞中。Sun 等［28］通過滾環(huán)擴增制得紗線狀的DNA 納米線球［圖1（a）］，與sgRNA 部分互補。載有Cas9/sgRNA復合物的DNA 納米線球還包被了陽離子聚合物PEI 的涂層，幫助誘導內涵體逃逸，可以有效將Cas9/sgRNA 復合物遞送到細胞核?；诓《疽職さ姆律{米顆粒也可以幫助CRISPR 系統(tǒng)的遞送。Cas9/sgRNA RNP 能被包裝成病毒樣顆粒［87-88］，實現(xiàn)高效的基因組編輯并有助于減少脫靶。

生物仿生納米載體的臨床轉化也受到一定的挑戰(zhàn)。比如，細胞膜衍生納米囊泡和細胞外囊泡等攜帶有供體細胞的信息，每個制劑的免疫原性和生物相容性需要詳盡評估［95］，放大生產的穩(wěn)定性和批次間均一性也是有待解決的重要問題［96］。

表1 列出了用于基因線路/編輯體系遞送的典型載體。

表1 用于基因線路/編輯體系遞送的典型載體Tab.1 Representative carriers used for delivering gene circuits/genome editing systems

1.2 納米器件作為信號轉導中介以調控基因表達

在合成生物學中，通過基因線路的設計實現(xiàn)基因的受控表達，有助于發(fā)展出更精準、智能的藥物治療和基因治療方式。在基因線路中，合成基因開關能夠接收并處理輸入信號，產生特定的輸出［97］。目前已經開發(fā)出多種轉錄基因開關和轉錄后基因開關，可在不同水平上進行基因表達的干預和調控［97］。通過內部環(huán)境刺激誘導基因開關的狀態(tài)變化可以實現(xiàn)自發(fā)響應，但容易導致基因開關處于不可逆的狀態(tài)［98］。光、聲、熱、磁等外部刺激可以根據(jù)需要而施加，易于操控，但缺乏空間控制的精確特異性［99］。引入納米粒子作為外部信號傳導的載體，可以將光、磁等信號轉換為能被基因開關識別的輸入信號，進而實現(xiàn)基因表達的時空控制。

磁信號可經納米粒子轉換為熱信號。Tang等［100］報告了一種熱誘導基因表達系統(tǒng)，在交變磁場下由Mn-Zn 鐵氧體磁性納米粒子產生熱能，用于激活熱誘導基因表達β-半乳糖苷酶。Ortner等［101］將磁性納米粒子和含有誘導型熱休克啟動子元件的細胞封裝成可植入膠囊［圖2（a）］，施加外界交變磁場使磁性納米粒子在膠囊內產生局部高熱，誘導表達熒光素酶報告基因，并減少熱量對植入部位其他細胞的影響。Yamaguchi 等［102］也利用磁鐵礦納米顆粒作為基因開關，用于癌癥治療。

除了磁、熱信號之間的轉換，納米系統(tǒng)還可以聯(lián)系起光、熱信號?；诖?，Lü等［103］開發(fā)了一種吸收NIR 光的樹枝狀半導體聚合物（dendronized semiconducting polymer， DSP），將其作為光熱納米載體［圖2（b）］。由熱休克啟動子調節(jié)的基因和DSP 形成納米復合物，在被細胞內化后，基因從復合物中釋放進入細胞核，留在胞質中的DSP 在NIR光照射下產生熱量，刺激熱休克因子單體轉變?yōu)槿垠w并易位到細胞核，與熱休克元件結合繼而啟動基因表達。Wang 等［104］則使用光熱響應共軛聚合物納米粒子作為傳感器，在NIR 光照射下

圖2 納米器件作為信號轉導載體以調控基因表達Fig.2 Nanodevices serve as signal transduction carriers to regulate gene expression

以較高的空間和時間分辨率遠程控制細胞內基因表達。金納米粒子也可以吸收特定波長光的光能并將其高效地轉化為熱能［98，105］。Aratboni 等［98］設計了構象受溫度誘導變化的RNA 溫度計作為基因表達調控元件，以金納米粒子作為熱源，用LED光進行光熱觸發(fā)生產蛋白質。

2 合成生物學成為助力納米技術應用的新引擎

在合成生物學構筑生物元件、組裝基因線路的需求驅使下，眾多基因工程工具被開發(fā)出來。運用這些工具對自然存在的生命體進行改造和編程，可以制造出更精妙的生物源納米制劑。經過基因工程化的細胞膜納米囊泡等表現(xiàn)出更優(yōu)的靶向性和免疫治療能力，在藥物靶向遞送和聯(lián)合免疫治療中具有廣闊的應用前景。

天然細胞或細胞膜衍生的納米囊泡，如細胞外囊泡（包括外泌體、小型微囊泡）和細胞膜衍生納米囊泡［106］，在生物醫(yī)學領域頗具應用潛力。與體細胞具有相似膜結構的細胞膜衍生物容易被識別為“自我”而不易被清除［106］。由于膜蛋白會對納米囊泡的功能產生決定性影響［107］，用合成生物學手段將細胞膜納米囊泡修飾上定制的膜蛋白，可以實現(xiàn)不同的功能。

外泌體本質上是多泡核內體（multivesicular endosomes， MVEs）成熟過程中，由核內體膜向內出芽而形成的腔內囊泡，在MVEs和細胞表面融合后分泌到細胞外［108］。相比傳統(tǒng)的納米顆粒，天然外泌體具有豐富的膜蛋白、高生物相容性和低免疫原性，是一種獨特的納米制劑［109］。通過基因工程方法改造細胞，可以獲得攜帶治療性分子［如PD-L1（programmed death-ligand 1）［110］、NF-κB抑制劑［111］等］的外泌體。利用工程化外泌體的靶向能力和尺寸效應，可以實現(xiàn)高效的疾病治療。Kojima等［112］受合成生物學啟發(fā)，設計了一種外泌體生產細胞，能高效地生產定制化外泌體，包裝并實現(xiàn)mRNA的腦內靶向遞送。Morishita等［113］對B16BL6 腫瘤細胞進行基因工程改造，使細胞生成的外泌體既含有腫瘤抗原，又容易修飾上免疫刺激性CpG DNA［圖3（a）］，作為腫瘤抗原-佐劑共遞送系統(tǒng)用于癌癥免疫治療。此外，Shi 等［109］開發(fā)了雙重靶向T 細胞CD3和乳腺癌細胞HER2受體的外泌體，相比雙特異性抗體而言表現(xiàn)出更好的乳腺癌免疫治療效果，合成多價抗體的重定向外泌體（synthetic multivalent antibodies retargeted exosome，

SMART-Exo）也有望成為下一代免疫納米藥物的平臺技術。綜上，基因工程化細胞外泌體可實現(xiàn)靶向藥物遞送、抗原佐劑呈遞，也可誘導免疫效應細胞和靶細胞間的相互作用。

小型微囊泡，直接由天然細胞膜向外出芽形成［108］，可以反映原始細胞所攜帶的抗原含量［106］。受此啟發(fā)，通過基因工程改造原細胞，隨后以出芽的方式仿生合成帶有穩(wěn)定高表達膜蛋白的微囊泡［114］，在智能遞送系統(tǒng)中展現(xiàn)出較大的潛力。病毒抗原、病毒特異性受體和病毒融合蛋白都可以在細胞膜上工程化過表達，出芽產生模擬病毒的納米囊泡，用于疫苗呈遞抗原［115］、抗病毒感染［116］以及遞送生物活性的大分子［117］。Zhang等［117］利用水泡性口炎病毒G 蛋白（vesicular stomatitis virus G protein， VSV-G）的融合活性制備可編程的細胞外囊泡（gectosomes），通過分裂的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）互補系統(tǒng)來主動裝載生物活性蛋白，減少其他胞內蛋白的非特異性封裝，并實現(xiàn)大分子向細胞內的高效遞送［圖3（b）］。Lü 等［118］通過基因工程手段將靶向配體嵌入到細胞膜，從供體細胞衍生出生物工程細胞膜納米囊泡，可用于遞送溶瘤病毒并使其逃避機體的先天免疫反應，增強對腫瘤細胞的靶向遞送，為腫瘤病毒療法提供新思路。不僅如此，在細菌中，革蘭氏陰性菌也從外膜產生細菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）［119］。類似前文所述，OMVs 也可以基因工程化后作為疫苗［120］、用于癌細胞靶向siRNA 遞送［121］和腫瘤免疫治療［122］。如Li 等［122］報告了表面插入PD-1（programmed death-1）的基因工程化OMVs，保護T 細胞免受PD1/PD-L1免疫抑制的影響，顯著提高抗腫瘤功效。

細胞膜通過擠出、超聲等方式獲得的納米囊泡，或將細胞膜包裹在合成核表面制成的納米顆粒，業(yè)已成為人們關注的仿生治療平臺［123-125］。裝載藥物，或攜帶有靶向受體、抗體的細胞膜衍生納米囊泡逐漸發(fā)展成為頗具潛力的制劑［126-129］。Zhang等［128］構建了表面展示PD-1受體的細胞膜衍生納米囊泡，并加載了吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase， IDO）的小分子抑制劑1-甲基-色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT），在阻斷腫瘤細胞表面PD-L1 的同時，克服腫瘤細胞和樹突狀細胞（IDO+DCs）過表達的IDO 對效應T細胞的抑制作用［圖3（c）］。

圖3 基因工程化的生物源納米制劑Fig.3 Genetically engineered biological nano-agents

除了從離體細胞中獲得仿生納米制劑外，也可以利用細胞原位釋放亞微米級顆粒的特性開發(fā)先進的藥物遞送系統(tǒng)［130］。例如，血小板作為血管損傷的監(jiān)測器，可以積聚到腫瘤手術傷口［131］，并在原位被激活，釋放出約200 nm 的血小板微粒（platelet microparticles， PMPs）［130，132］。表面綴連PD-L1抗體的血小板被證明能以血小板微粒的形式釋放PD-L1抗體，用于癌癥免疫治療［133-134］。Zhang等［131］對 血 小 板 的 前 體 細 胞—— 巨 核 細 胞（megakaryocyte， MK）進行基因工程改造以表達PD-1，并在體外產生表達PD-1 的成熟血小板。血小板靶向手術傷口內的腫瘤細胞，激活產生帶有PD-1的PMPs，阻斷腫瘤細胞的PD-L1，逆轉CD8+T細胞耗竭，從而抑制腫瘤術后復發(fā)［圖3（d）］。MK細胞同樣可以經基因編程后過表達PD-L1，產生免疫抑制性血小板，抑制自身反應性T細胞，用于逆轉高血糖非肥胖糖尿?。╪on-obese diabetic，NOD）小鼠的新發(fā)1型糖尿?。?35］。

利用合成生物學技術進一步編程仿生系統(tǒng)，可使其能夠主動感知體內信號并自主生產納米載體，以應對需要持續(xù)給藥治療的疾病，從而能進一步拓展納米技術的應用潛力。

3 合成生物學和納米生物學融合發(fā)展

3.1 模塊化的納米功能組件

合成生物學提供了一個定制化的框架來實現(xiàn)功能化組件的構建、組合，并將其封裝成合成生物系統(tǒng)［15］。從工程學思路出發(fā)，合成生物學家將復雜的“系統(tǒng)”分解為獨立的“設備”集［3］，提供標準生物功能化組件的工具包，使得它們像搭積木一樣易于建模和組合使用。合成生物學的模塊化特性與納米載體的構筑非常匹配適應［136］。核酸、蛋白質、有機聚合物、無機材料［137］等可以作為建筑材料，自組裝搭建成納米級合成隔室、納米反應器等組件［138］。這些模塊化的功能組件不斷擴充合成生物系統(tǒng)的工具包，可以用作藥物遞送的仿生控釋載體，甚至構建人工細胞。

對DNA的操縱改造，除了通過DNA重組構建起定制化基因線路、使細胞表現(xiàn)出定制的生物功能之外，也可以將DNA本身用作自組裝構建材料。DNA 能以高度嚴格的堿基配對制造出特定的納米結構［139］。傳統(tǒng)的DNA自組裝主要以小的構筑模塊形成大的結構，如拼貼組裝形成的四面體、DNA納米籠等獨立結構，以及基于DNA 瓦片的無限網絡結構［140］。DNA 折紙的提出為DNA 自組裝引入新的活力，它以一條長的單鏈DNA 為支架，以數(shù)百個定制的短單鏈DNA 為訂書釘來折疊支架形成特定的形狀，表現(xiàn)出更強大的構建復雜、不規(guī)則結 構的能力［141］。通 過DNA 折紙 和DNA 磚塊［142］等技術構建出的框架核酸，具有高度可編程性和可尋址性的優(yōu)勢［143-144］，可以作為藥物智能釋放［145］、疫苗精確接種［146］和生化反應［147］的平臺。如Li等［145］通過DNA 折紙構建的智能DNA 納米機器人已經被用于精準藥物遞送，可以將活性凝血酶保護，精確遞送至腫瘤后再暴露出來。Liu 等［146］開發(fā)的管狀DNA 納米器件疫苗可以有效遞送抗原和佐劑，并在抗原呈遞細胞的溶酶體內響應pH而暴露，以激活強烈的免疫反應。為組裝更大尺寸（微米）的DNA 結構，Yao 等［148］開發(fā)了一種六螺旋DNA 折紙束作為元DNA（Meta-DNA）進行構建，此策略有望用于定位可編程的功能組件。

蛋白質也可以自組裝為蛋白質納米籠、病毒樣顆粒等結構，用于靶向遞送、疫苗設計［149-150］和生物傳感［151］。細菌微區(qū)室是一種自然進化的可封裝蛋白質，可以用遺傳技術實現(xiàn)在細菌體內的封裝，構建納米生物反應器，模擬細胞器［152］。脂質、聚合物等經過定向合成和修飾，也可以構筑出仿生的隔室，開發(fā)成一系列生物催化納米反應器、觸發(fā)響應型納米囊泡等功能組件，從而進一步形成仿生細胞器或藥物遞送系統(tǒng)。Edlinger等［153］將基因工程改造的通道膜孔蛋白引入聚合物囊泡作為生物閥，構建一種pH 響應性的生物催化納米隔室［圖4（a）］，根據(jù)外部環(huán)境pH 的刺激可逆地開/關閥門，允許底物分子流入加載酶的隔室而觸發(fā)反應。Yu等［154］用缺氧和H2O2雙敏感兩嵌段共聚物自組裝形成的納米囊泡包裝葡萄糖氧化酶和胰島素，可以實現(xiàn)血糖響應型囊泡解離和胰島素釋放。在此基礎上，多室結構“囊泡嵌囊泡”的仿生人工胰島細胞（artificial beta cells，AβCs）被構建出［圖4（b）］，外部大囊泡（outer large vesicle， OLV）模擬質膜，內部小脂質體納米囊泡（inner small liposomal vesicles，ISVs）裝有胰島素模擬成熟β細胞內的儲存顆粒［155］。該系統(tǒng)配備了與葡萄糖相關的代謝系統(tǒng)，并具有pH 可控的膜融合機制，作為一種仿生胰島素遞送系統(tǒng)，有效地應對高血糖。

除了利用脂質、聚合物等合成多隔室囊泡來模擬生命的簡化特征外，無機材料也可以組裝成納米反應器，并模擬在多個連續(xù)的隔室中發(fā)生的酶促級聯(lián)反應［156-157］。酶促反應的多隔室化是生命體的一個重要特征，它允許細胞實現(xiàn)酶促生化反應的精密控制與時空分離［158］。在合成實體中，將酶促級聯(lián)反應限制于合成“模塊”中，每個模塊負責單獨的反應，模擬交互式級聯(lián)代謝，是合成生物學構建復雜的人工細胞的一項重要挑戰(zhàn)［159］。Jo等［159］在油包水型微乳液中，用氨丙基三甲氧基硅烷（aminopropyl trimethoxysilane，APTMS）和酶的偶聯(lián)反應以及溶膠-凝膠縮聚反應，合成了共價封裝三種酶（β-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶）的二氧化硅納米粒子，作為酶促納米反應器［圖4（c）］，封裝酶的二氧化硅納米粒子進一步被限制于乳液的液滴中，組成了多隔室的仿生交互式級聯(lián)網絡。

圖4 模塊化的納米級功能組件Fig.4 Nanoscaled modular functional components

綜上，一系列納米功能組件的構建，為整合封裝多種功能模塊，從而模擬復雜的生命系統(tǒng)創(chuàng)造了眾多機會［17］。

3.2 納米人工雜合系統(tǒng)

通過納米元件和底盤生物模塊的定向精準組裝，可構建結構和功能可控的納米人工雜合生物系統(tǒng)，包括納米雜合工程化菌株、嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell， CAR-T）等。一方面，工程化的底盤生物具有幫助靶向遞送納米藥物的能力；另一方面工程化底盤生物和納米功能元件聯(lián)合，構建出體內外運動行為高度可控的工程化雜合生物系統(tǒng)，能夠發(fā)揮雙重療效，或用于成像和體內跟蹤。

3.2.1 “工程化細菌-納米”雜合系統(tǒng)

一些特定的細菌可以特異性靶向腫瘤病灶，自驅動穿透低氧的腫瘤組織［160］，同時顯著減少對正常組織的損傷?；谄洫毺氐哪芰Γ梢詫⒓毦鳛橐环N理想的抗癌制劑。由于細菌的基因已經很容易被操縱，通過合成生物學方法改造，產生能自主推進、響應外界信號、感知局部環(huán)境并可以從外部檢測到的工程化細菌，成為一種備受關注的腫瘤治療策略［161-163］。隨著納米技術的發(fā)展，將細菌療法、合成生物學技術和納米技術交叉融合，構筑的功能集成的“工程化細菌-納米”雜合系統(tǒng)，可以用于腫瘤精準治療：一方面，工程化細菌可以高效、靶向、可控地運輸納米藥物［164］，或實現(xiàn)腫瘤可視化生物成像［165］；另一方面，納米顆粒改性的工程菌可以作為生化反應平臺，實現(xiàn)不同腫瘤療法的聯(lián)合［166］。

納米藥物治療癌癥的療效與藥物在腫瘤內分散的濃度有關。納米顆粒全身給藥后向腫瘤的遞送、納米治療藥物在腫瘤內的血管外轉運會受到一些物理和生物屏障的限制，腫瘤微血管網絡高度不規(guī)則的結構、腫瘤內較高的間質液壓力等阻礙了納米載體的被動擴散，進而阻礙了對腫瘤的治療［167-168］。細菌能在瘤內滲透，可以被用來將納米治療藥物特異性靶向腫瘤，并有效地輸送到難以從循環(huán)進入的部位［168］；經過改造的趨磁性細菌可在外界控制下進一步實現(xiàn)在瘤內的定向遷移［162］。細菌的深層組織穿透性，還助力腫瘤定位和成像技術的拓展。由于人體組織對光的高度屏障作用，常用的光學成像技術在深部組織中應用的性能不佳。Bourdeau等［165］在細菌中引入編碼納米氣體囊泡的工程基因簇，作為超聲波的報告基因，可進行超聲造影［圖5（b）］，提供了一種在哺乳動物體內深處可視化的方法，有望促進腫瘤診斷和治療的發(fā)展。表2 列出了代表性的工程化細菌-納米組件雜合系統(tǒng)。

表2 代表性的工程化細菌-納米組件雜合系統(tǒng)Tab.2 Representative hybrid systems of engineered bacteria and nanocomponents

圖5 納米人工雜合系統(tǒng)Fig.5 Biological chassis hybrid systems engineered at nanoscale

以細菌為平臺還能匯聚多種腫瘤治療策略。工程化細菌經過納米顆粒雜合修飾后，可以完成光、熱信號轉化，從而實現(xiàn)生化反應［169］、光控細菌代謝物療法［161］、光熱療法［160］、光動力療法［166］等的聯(lián)合。Fan 等［169］用質粒構建了具有呼吸鏈酶Ⅱ（NDH-Ⅱ）過表達的大腸桿菌，并在表面修飾磁性Fe3O4納米粒子，實現(xiàn)在原位催化Fenton 樣反應［圖5（a）］，產生過氧化氫誘導腫瘤死亡。Chen等［160］開發(fā)了載有吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）的納米粒子作為納米光敏劑，利用基因工程化鼠傷寒沙門氏菌YB1 的缺氧靶向能力將納米粒子遞送入腫瘤缺氧核心，在NIR 激光照射下實現(xiàn)高效光熱治療。Deng 等［166］改造了表達過氧化氫酶的大腸桿菌，結合聚多巴胺的光熱轉換能力和二氫卟酚e6（chlorin e6，Ce6）的光敏作用，實現(xiàn)細菌的腫瘤靶向和光熱療法、光動力療法的聯(lián)合。

3.2.2 “CAR-T細胞-納米”雜合系統(tǒng)

在工程化細胞領域，T 細胞經過基因工程改造得到的CAR-T 細胞，為癌癥免疫治療帶來了新的活力［171］。雖然CD19 特異性CAR-T 細胞已經被美國FDA 批 準 用 于 治 療B 細 胞 惡 性 腫 瘤［172］，但CAR-T 在對實體瘤的治療上遇到了重重阻礙：對實體瘤較低的浸潤效率、腫瘤中存在的大量免疫抑制性細胞以及細胞因子等形成的免疫抑制性微環(huán)境［171］。功能性納米材料為增強CAR-T 細胞對實體瘤的治療效能提供新的思路，將納米材料與CAR-T細胞雜合構建的生物系統(tǒng)，可以促進CAR-T在實體瘤中的浸潤，提高腫瘤殺傷的療效；也用于成像技術，跟蹤檢測CAR-T的組織分布和去向。

載有治療藥物、佐劑的納米載體雜合到CAR-T細胞表面，能將輔助藥物遞送和T 細胞活化相偶聯(lián)，增強CAR-T 細胞的腫瘤治療效力。Tang 等［173］將裝載大量人IL-15 超激動劑（huamn interleukin-15 superagonist， IL-15Sa）的蛋白質納米凝膠結合到CAR-T 細胞表面［圖5（c）］。形成納米凝膠所需要的交聯(lián)劑為含二硫化物的雙-N-羥基琥珀酰亞胺（disulphide-containing bis-N-hydroxy succinimide，

NHS-SS-NHS），當T 細胞被激活時，細胞表面的氧化還原活性增加，觸發(fā)NHS-SS-NHS 交聯(lián)劑響應還原條件而斷裂，釋放IL-15Sa。相比游離IL-15Sa 全身性給藥用作佐劑而言，負載IL-15Sa 納米凝膠的CAR-T 細胞具有更強的治療潛力，實現(xiàn)人膠質母細胞瘤清除率的顯著增加，同時也可提高IL-15Sa的安全給藥劑量。帶有響應性PD-1抗體的磁性納米團簇［174］、含有藥物阿伐麥布的脂質體［175］、載有阿霉素的聚合物納米顆粒［176］、裝載A2a 腺苷受體拮抗劑的交聯(lián)多層脂質體囊泡［177］等也被開發(fā)連接到CAR-T 表面，以發(fā)揮治療藥物和過繼性T細胞的雙重療效。Chen等［178］將納米粒子介導的光熱療法和CAR-T 相聯(lián)合，腫瘤的光熱消融及釋放的腫瘤特異性抗原可以增強CAR-T 細胞的腫瘤浸潤和活化。Hu 等［179］還用微納材料協(xié)同遞送CAR-T 細胞、負載保持CAR-T 活性和增殖能力的細胞因子的納米顆粒以及PD-L1 抗體，增強CAR-T治療實體瘤的療效。

在成像平臺技術方面，Harmsen等［180］使用正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）和近紅外熒光（near infrared fluorescent，NIRF）雙模式的納米顆粒來標記CAR-T，可以高靈敏度地實現(xiàn)PET/NIRF成像［圖5（d）］，實現(xiàn)過繼細胞轉移后長達一周的全身跟蹤，對評估CAR-T在體內的分布、優(yōu)化CAR-T療法具有指導作用。

4 總結與展望

近些年，合成生物學和納米生物學的學科交叉與融合取得了顯著的進展，主要體現(xiàn)在以下四個方面：①納米遞送載體因其易功能化、靶向性等特點極大地提高了基因線路以及基因編輯體系的體內遞送效率；納米材料作為信號控制與轉導的開關，為合成基因線路的調控提供了豐富的選擇。②在合成生物學編輯技術的助力下，生物源納米制劑可被基因工程化改造，多功能的生物源納米制劑作為聯(lián)合治療平臺的潛力被發(fā)掘。③在合成生物學“自下而上”構建合成生物系統(tǒng)的思路指引下，以無機、有機和生物材料搭建成眾多的納米功能組件，可以模塊化地應用，組裝成定制化的生物系統(tǒng)。④將納米元件和合成生物學改造的底盤生物模塊雜化形成的納米人工雜合系統(tǒng)，可以響應外在物理信號和體內生化信號，實現(xiàn)時空控制或自主靶向驅動，發(fā)展出聯(lián)合療法和成像診斷的新工具。

綜上所述，本文重點闡述了交叉融合的合成生物學和納米生物學的最新發(fā)展，特別是在基因編輯、藥物遞送以及醫(yī)學成像等生物醫(yī)藥領域的應用?；ハ嘟徊娌⒒ハ噘x能的合成生物學和納米生物學奠定并形成了一個潛力巨大的學科增長極。

對于納米生物學和合成生物學來說，一個學科的進步將給另一個學科產生新的工具、帶來新的啟發(fā)。隨著納米技術的進一步發(fā)展，一系列納米級元件可能用作催化劑、傳感器和遞送載體等，更精妙地實現(xiàn)基因線路的構建、基因線路的開關調控，以及在體基因編輯改造的完成。合成生物學可根據(jù)人類意愿構建出特定的生物分子或生態(tài)系統(tǒng)，自主生產納米材料和生成納米制劑，實現(xiàn)納米制劑的增效減毒。

仿生化是納米生物學和合成生物學趨同的一個重要標志［181］，也是該領域發(fā)展的一個重要方向。向自然模擬和從自然啟發(fā)，可以用合成生物可持續(xù)性地生產仿生制劑，直接用于體內疾病治療；抑或通過納米功能組件的模塊化自組裝，開發(fā)出功能集成的納米合成生物系統(tǒng)，進一步構建智能化的仿生生物系統(tǒng)，用作疾病智能診斷和精準治療的一體化平臺。

合成生物學和納米生物學未來的融合發(fā)展可能會特別注重如何實現(xiàn)標準化和模塊化。標準化是納米裝置實施構建和易于操作的基礎［136］。生物元件的模塊化是合成生物學的一個普適性假設［182］。設計出標準化的合成通用接口和調控元件，實現(xiàn)功能模塊的定向集成，可以規(guī)?；瘶嫿{米合成生物系統(tǒng)。同時，結合多模態(tài)成像技術、熒光共振能量轉移、多組學分析等多學科方法，分析技術亟待發(fā)展以用于納米合成生物系統(tǒng)的在體監(jiān)測與評價。合成納米生物制劑的生物分布、對非靶向組織的影響以及代謝歸宿也應當進一步研究揭示，為其臨床轉化和規(guī)?；a應用奠定基礎。

可以預見，在合成生物學和納米生物學的共同驅動下，二者將持續(xù)深度融合發(fā)展，協(xié)調推進相關技術的迭代和升級。