韓納姝，方榮灃，王振江，李薇

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 精神衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

轉(zhuǎn)錄因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）是小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，定位于6號染色體上，全長52 246 bp，編碼蛋白長度為19～159個氨基酸[1]。近年來，TFEB作為影響溶酶體功能、細胞自噬和細胞代謝等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子成為研究熱點[2-3]。研究表明，TFEB是帕金森癥、阿爾茲海默癥等多種神經(jīng)退行性疾病及癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，在胰腺癌[5]、糖尿病[6]的治療中可能起著重要的調(diào)控功能。隨著研究的不斷深入，TFEB作為頑疾尤其是作為治療腫瘤疾病的一種新的策略靶點得到了越來越多的研究人員的關(guān)注[7]。TFEB與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系已經(jīng)取得了較多的研究成果。許多非整倍體腫瘤細胞系不顯示溶酶體飽和度，說明腫瘤細胞具有其他的機制來增強其降解能力[8]。腎細胞癌（RCC）是由腎小管上皮產(chǎn)生的異質(zhì)性腫瘤，其中的易位RCC（t-RCC）是由MiTF/TFE家族成員TFE3和低頻率的TFEB有關(guān)的基因融合引起的[9]，對高分期的腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)了包括TFEB在內(nèi)的染色體6p擴增這一新的細胞遺傳學(xué)變化[5-10]。TFEB的表達與卵巢癌的自噬和侵襲性臨床特征相關(guān)，TFEB表達的高低是卵巢癌的預(yù)后因子[11]。過表達TFEBS142A突變體能夠刺激自噬發(fā)生，促進腫瘤生長[12]。

本研究擬將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TFEB-HA轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中并成功表達，為進一步研究TFEB對細胞生長的影響提供一個新的有力的工具，同時也可以為進一步研究從基因水平上治療腫瘤、神經(jīng)精神等疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌種及細胞

表達載體pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、大腸桿菌（E.coli）Top 10、人子宮頸癌HeLa細胞，均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ及BamHⅠ）、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白預(yù)染Marker及TurboFect?等，Thermo公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，上海生工；胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基，Sigma公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基，Gibco公司；羊抗兔TFEB抗體、羊抗鼠β-actin抗體， Santa公司；680 goat anti-rabbit IgG（H+L）、680 goat anti-mouse IgG（H+L），Invitrogen公司。引物合成和基因測序由北京華大基因公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-3000型PCR基因擴增儀，Techne公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+型全自動DNA凝膠成像儀、Mini Protean 3 Cell型小垂直板電泳槽、1703940型半干轉(zhuǎn)膜儀、轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad公司；XDS-200型倒置顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；BB15型細胞培養(yǎng)箱，Thermo有限公司；CLX型Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)，LiCOR公司。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計引物

參考NCBI公布的人TFEB基因序列設(shè)計PCR引物，兩端分別加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點及保護堿基，下游引物連接HA標(biāo)簽。引物序列上游為5’-GGAATTCATGGCGTCACGCATAGGGTTGC-3'，下游為5'-CGGGATCCTTAAGCGTAATCTGGAACATC GTATGGGTACAGCACATCGCCCTCCTCCATGC-3'。

1.3.2 PCR擴增

以HeLa細胞基因組為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系：10× Pfu Buffer （含MgSO4) 10μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、模板1 μL、Pfu DNA聚合酶（2.5 U/μL）1 μL、ddH2O 82 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 3 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化DNA擴增產(chǎn)物。

1.3.3 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA表達載體的構(gòu)建

將純化后的目的基因片段與pcDNA3.1（+）載體分別用EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切后純化回收，T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop 10感受態(tài)細胞，在含有200 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒，分別進行PCR驗證、雙酶切驗證及測序鑒定。

1.3.4 細胞培養(yǎng)

用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細胞，定期換液傳代。

1.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

用 Turbofect? 將 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞融合度達60%～70%的HeLa細胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6 Western Blot檢測

Western Blot檢測轉(zhuǎn)染及對照HeLa細胞TFEB蛋白表達水平，結(jié)果利用ODYSSEY紅外成像檢測。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，檢驗結(jié)果P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建了4個重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA，雙酶切（EcoRⅠ/BamHⅠ）此4個重組質(zhì)粒，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。重組質(zhì)粒1的雙酶切產(chǎn)物在約1 500 bp處有一特異性條帶，大小與TFEB基因相符，另一條帶的大小與pcDNA3.1（+）載體大小相符，2、3、4中無TFEB基因條帶。說明重組質(zhì)粒1構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA的雙酶切驗證

將PCR驗證和雙酶切驗證均正確的重組質(zhì)粒1進行測序，測序結(jié)果表明融合基因無堿基突變和缺失，載體上插入的TFEB cDNA序列方向、位置及大小均正確，進一步證明pcDNA3.1（+）-TFEB-HA重組表達載體構(gòu)建成功。

2.2 Western Blot檢測結(jié)果

按照方法1.3.5進行轉(zhuǎn)染并用Western Blot檢測，如圖2所示，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒細胞的蛋白量（TFEBHA）明顯多于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（Control），表明目的基因轉(zhuǎn)染成功。統(tǒng)計分析結(jié)果如圖3顯示，TFEB-HA組的TFEB蛋白表達水平顯著高于對照組。

圖2 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后TFEB-HA蛋白表達

圖3 TFEB-HA蛋白表達水平

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建的質(zhì)粒能夠正確表達TFEB，構(gòu)建的載體可行性好、不破壞細胞自身結(jié)構(gòu)，易于觀察，方便定量表達外源蛋白，為進一步研究TFEB在腫瘤發(fā)生機制中的作用提供了一個新的工具，為從基因水平上治療腫瘤提供了一定的理論依據(jù)。