楊莎　蔡仁蓮　陳緒美　趙帥　田瑩　郭建軍

摘要：為探究九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，設(shè)置空白組、對(duì)照組與水煎液藥物組（濃度10、20、30、40 mg/mL），采用細(xì)胞形態(tài)法觀察九香蟲水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，MDC染色法檢測(cè)細(xì)胞的自噬作用，Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果表明，不同濃度九香蟲水煎液均可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞皺縮與漂浮并產(chǎn)生細(xì)胞碎片;九香蟲水煎液能抑制HepG2細(xì)胞體外增殖，促進(jìn)其自噬與凋亡，且呈劑量依賴性，IC₅₀為26.23 mg/mL。研究表明，九香蟲水煎液通過調(diào)控細(xì)胞增殖、自噬與凋亡，發(fā)揮對(duì)HepG2細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用。

關(guān)鍵詞：九香蟲水煎液;肝癌;HepG2;抑制作用

中圖分類號(hào)：Q969.97文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2022）03-0074-06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.03.011

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。統(tǒng)計(jì)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例與死亡病例分別為905 677與830 180例，且死亡率超過胃癌，從2018年的第三順位提升至2020年的第二順位[1];在中國(guó)，肝癌的形勢(shì)則更加嚴(yán)峻，2020年發(fā)病率與死亡率接近世界平均水平的兩倍[2]。目前肝癌的西醫(yī)療法主要有手術(shù)切除、動(dòng)脈介入、放射療法等，但面臨復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，并伴隨著一系列副作用[3];傳統(tǒng)中醫(yī)具有防癌變、抑惡化、促修復(fù)等[4]作用，常成為癌癥治療的有效補(bǔ)充。

九香蟲（Aspongopus chinensis Dallas，1851）隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae[5]，為民間常見蟲類中藥，具有理氣止痛、溫中助陽(yáng)的功效[6]。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，九香蟲抗癌、抗菌、抗凝血等[7]功能逐漸得以研究。研究表明，九香蟲具有抗乳腺癌[8]、胃癌[9]、肝癌[10]、結(jié)腸癌[11]等作用。在傳統(tǒng)中藥復(fù)方中，九香蟲常與其他藥物配伍使用，且水煎液為常用的給藥方式[12]，但對(duì)其水煎液?jiǎn)为?dú)作用于癌癥的研究較少，僅見田瑩等[13]對(duì)乳腺癌的研究報(bào)道，對(duì)九香蟲水煎液作用于肝癌的研究更是鮮有報(bào)道。本研究通過體外細(xì)胞試驗(yàn)，研究了九香蟲水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2體外生長(zhǎng)作用的影響，以期為九香蟲水煎液在肝癌的臨床應(yīng)用上奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為九香蟲藥用價(jià)值的深層次開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1主要材料及儀器

1.1.1生物材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司;九香蟲成蟲采集于貴州凱里市黃平縣重安鎮(zhèn)（E 107.80°，N 26.52°）。

1.1.2試驗(yàn)試劑

含1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）、3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Amresco公司）、Hoechst 33258染料（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒-MDC法（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3試驗(yàn)儀器

0.22 μm針管式過濾器（美國(guó)Millipore公司）、超低溫冰箱（浙江捷盛制冷科技有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、生物安全柜（西班牙Telstar公司）、離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、倒置相差顯微鏡（廈門麥克奧迪公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1九香蟲水煎液的制備

-80 ℃冰箱取出九香蟲成蟲，純水沖洗兩遍，烘干研磨成粉，取50 g蟲粉加入100 mL純水，浸泡30 min后于砂鍋中煎煮60 min，小火濃縮至1 g/mL的九香蟲水煎液。所得液體先后經(jīng)紗布與濾紙過濾，6000×g、10 min離心2次，吸取上清于生物安全柜經(jīng)0.22 μm濾頭過濾除菌，用1.5 mL無(wú)菌離心管分裝并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清與1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37? ?℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察及MTT法檢測(cè)九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化處理，接種于96孔培養(yǎng)板（1×10⁴個(gè)/孔）。設(shè)置空白組（未接種細(xì)胞）、對(duì)照組（未加藥物）以及試驗(yàn)組（10、20、30、40 mg/mL）共6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞鋪滿至孔底總面積的80%～90%后，棄掉培養(yǎng)液，空白組與對(duì)照組每孔加入100 μL MEM培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入不同九香蟲水煎液濃度的培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照記錄。拍照后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% MTT（5 g/L）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力（%）=（試驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）×100%。

1.2.4九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響采用MDC法檢測(cè)九香蟲水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，消化細(xì)胞接種于24孔板（2×10⁴個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔按1.2.3加入相同濃度含九香蟲水煎液的培養(yǎng)液500 μL，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，加入10 μL MDC染液，37? ℃避光染色30 min，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的影響采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)九香蟲水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，細(xì)胞處理同1.2.4。加藥培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入300 μL甲醇固定30 min，棄甲醇，加入100 μL Hoechst 33258染液37 ℃避光染色15 min，PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以Mean±SEM表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)觀察及MTT法檢測(cè)九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響不同濃度九香蟲水煎液作用于HepG2細(xì)胞24 h后，對(duì)照組的細(xì)胞飽滿圓潤(rùn)，輪廓清晰，貼壁性良好且細(xì)胞分布致密，無(wú)細(xì)胞碎片產(chǎn)生（圖1-a），而試驗(yàn)組（圖1-b～e）則出現(xiàn)不同程度細(xì)胞皺縮，細(xì)胞碎片，細(xì)胞漂浮以及分布稀疏的現(xiàn)象，且隨著濃度的增加，細(xì)胞皺縮、漂浮與細(xì)胞碎片數(shù)量增多，當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)幾乎無(wú)貼壁細(xì)胞（圖1-e）。

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。隨著九香蟲水煎液濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低（P<0.01），表明九香蟲水煎液具有顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，且呈濃度依賴性（圖2）。九香蟲水煎液作用于肝癌HepG2細(xì)胞24 h的半抑制濃度（IC50）為26.23 mg/mL。

2.2九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響MDC染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的黃綠色熒光，試驗(yàn)組則熒光強(qiáng)度增加，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂呈大小不一的點(diǎn)狀，被染成致密的藍(lán)綠色顆粒（圖3）。隨著九香蟲水煎液濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核碎片增加，表明九香蟲水煎液促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬體形成。

2.3九香蟲水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的影響Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照組呈彌散均勻熒光（圖4-a），低濃度九香蟲水煎液（圖4-b、c）作用下細(xì)胞出現(xiàn)少量致密濃染，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整;高濃度九香蟲水煎液（圖4-d、e）作用下細(xì)胞出現(xiàn)明顯裂解，可見濃染致密的塊狀熒光。較對(duì)照組，試驗(yàn)組細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核染色增強(qiáng)，且隨著濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)破碎。綜上所述，九香蟲水煎液能顯著促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。

3結(jié)論與討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤的研究與運(yùn)用逐漸受到重視[14]。藥用昆蟲是指其蟲體或產(chǎn)物具有治療疾病的昆蟲，是癌癥治療藥物重要的組成部分[15]。研究表明，斑蝥素、蜣螂毒素、蟑螂油等具有良好的抗癌活性;此外，蜜蜂、螞蟻、胡蜂等膜翅目及部分蝶類昆蟲體內(nèi)也具有一定的抗癌活性物質(zhì)[16]。

九香蟲作為一種傳統(tǒng)藥食兩用昆蟲[17]，其傳統(tǒng)中藥復(fù)方多有用于抗癌，如九香巖痛寧（九香蟲、鼠婦、元胡等）[18]、癌痛克（金蝎、九香蟲、土元等）[19]、復(fù)方香龍散（九香蟲、半夏、天龍等）[20]，等。隨著研究的不斷深入，針對(duì)其單獨(dú)抗癌作用也開展了諸多研究：如九香蟲含藥血清可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)因子的表達(dá)[21];九香蟲血淋巴可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞體外增殖[22];九香蟲三氯甲烷浸出物、水提液、乙醇粗提物等可通過阻滯細(xì)胞周期達(dá)到抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞的增殖作用[10，23-24];并進(jìn)一步從其體內(nèi)純化獲得可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的CHP蛋白[25]。本研究則進(jìn)一步明確了其對(duì)肝癌的抑制作用，也是九香蟲單藥水煎液模式對(duì)肝癌抑制作用的首次探索。本研究可為九香蟲這一優(yōu)良中藥的深入系統(tǒng)應(yīng)用提供參考。

其次，在已獲得的九香蟲多種組分中，水煎液的制作方式更加簡(jiǎn)單、快速。因而本文探討了九香蟲水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)九香蟲水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力以及對(duì)細(xì)胞凋亡與自噬作用的影響與藥物濃度呈顯著正相關(guān)，說明九香蟲水煎液具有顯著抑制肝癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的作用，且其肝癌HepG2細(xì)胞的IC₅₀為26.23 mg/mL。而田瑩等[13]發(fā)現(xiàn)，九香蟲單藥水煎液對(duì)乳腺癌MDA-MB-453、4T1細(xì)胞的IC₅₀分別為34 mg/mL、101 mg/mL，初步表明九香蟲水煎液相較于乳腺癌MDA-MB-453、4T1細(xì)胞更有效果。另外，侯曉暉等[24]利用九香蟲乙醇粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞的IC₅₀為582 μg/mL，相較于水煎液，其抗癌功效似乎更高，這可能與昆蟲體內(nèi)物質(zhì)更多是醇溶性有關(guān)，乙醇可以更有效地萃取出九香蟲體內(nèi)的抗癌活性物質(zhì)，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

此外，作為一種湯劑，水煎液具有易吸收、見效快以及隨癥加減的特點(diǎn)[26]，在臨床上具有良好的應(yīng)用潛能，但水煎液中可溶解的藥物成分多種多樣，確切的藥用成分及其對(duì)肝癌細(xì)胞抑制的具體分子機(jī)制仍不明確，也有待進(jìn)一步研究。

（責(zé)任編輯：段麗麗）參考文獻(xiàn)：

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Effect of Aspongopus chinensis Decoction on the Growth of Hepatoma Cells HepG2 in Vitro

Yang Sha Cai Renlian Chen Xumei Zhao Shuai Tian Ying Guo Jianjun

（1.Institute of Entomology，Guizhou University/Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of the Mountainous Region，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.Department of Histology and Embryology，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000，China）

Abstract：To investigate the effect of Aspongopus chinensis decoction on the growth of hepatoma cells HepG2 in vitro.Blank group，control group and drug groups of decoction （concentrations：10，20，30，40 mg/mL） were set，and cell morphology method was applied to observe the effect of the decoction on the morphology of HepG2 cells.MTT method was used to detect the proliferation activity of cells，MDC staining method was detected the autophagy of cells，and Hoechst 33258 staining method was detected the apoptosis of cells.The results showed that the decoction of A.chinensis could cause HepG2 cells to shrink and float，and produce cell debris;In addition，it also could inhibit the proliferation of HepG2 cells in vitro and induce autophagy and apoptosis in a dose-dependent manner，with the IC50 of 26.23 mg/mL.The study proved that the decoction of A.chinensis could exert inhibitory effect on the growth of HepG2 cells in vitro through regulating cell proliferation，autophagy and apoptosis.

Keywords：Aspongopus chinensis decoction;liver cancer;HepG2;inhibitory effect