次旦白瑪，彭燕娟，索朗卓嘎，李鴻仁

西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠,西藏拉薩 850008

肉毒梭菌是指能夠生產(chǎn)肉毒梭菌毒素，引起動(dòng)物中毒的細(xì)菌總稱，其中C型肉毒梭菌最為常見(jiàn)。肉毒梭菌，也稱肉毒梭狀芽孢桿菌，是一種革蘭氏陽(yáng)性芽孢梭菌，嚴(yán)格的厭氣菌，兩端鈍圓，多單在或成對(duì)，無(wú)莢膜，易于在液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基上形成芽孢，芽孢卵圓形，位于菌體近端。適合生長(zhǎng)溫度為28～37 ℃，pH為6.8～7.6。肉毒毒素并非肉毒活的肉毒桿菌釋放，而是先在肉毒桿菌細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)無(wú)毒的前體毒素，在肉毒桿菌死亡自溶后才具有毒性。

肉毒中毒分布于世界各地，我國(guó)主要分布在新疆、西藏、甘肅等地區(qū)，發(fā)病主要以青壯年牛為主，病死率高，常規(guī)治療無(wú)效。肉毒梭菌是一種土壤腐生性細(xì)菌，通常以芽孢形式廣泛分布于自然界和動(dòng)物腸道，在適當(dāng)環(huán)境條件下，芽孢發(fā)芽形成繁殖體，生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生毒素。肉毒梭菌芽孢有很強(qiáng)的抵抗力，在180 ℃下干熱5～15 min，100 ℃濕熱5 h左右，或高壓蒸汽121 ℃溫度滅菌30 min才能殺死肉毒梭菌芽孢。我廠肉毒梭菌C型滅活疫苗免疫效果良好，對(duì)牛羊的C型肉毒梭菌中毒癥得到了控制。我廠仍以常法生產(chǎn)，存在著產(chǎn)毒能力低、免疫注射計(jì)量大，給預(yù)防注射帶來(lái)一定的困難，疫苗生產(chǎn)成本也較高，為此進(jìn)行了此次試驗(yàn)[1]。

1 材料

1.1 菌種

肉毒梭菌C型菌株CVCC60353購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 儀器

離心機(jī)型號(hào)：TGL-16LM-B；生物安全柜型號(hào)：BSC-1300ⅡA2；電熱恒溫培養(yǎng)箱型號(hào)：DHP-9272；冷藏冷凍箱型號(hào)規(guī)格：BCD-221WRB1NYC；顯微鏡 OLYMPUS CX41；電子天平型號(hào)：FA2004B。

1.3 培養(yǎng)基

肉肝胃酶消化湯半固體：西藏生藥廠小培組提供；新鮮肝子：研發(fā)組取健康兔子肝；50%葡萄糖；自制培養(yǎng)基：西藏生藥廠研發(fā)室制備。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

由西藏生藥廠質(zhì)檢室動(dòng)物組提供，SPF級(jí)，體重14～16 g健康小鼠，隨機(jī)編組，不分雌雄。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組

為了更能說(shuō)服改進(jìn)后肉毒梭菌C型毒力提高，我們做了三次重復(fù)試驗(yàn)，即分為第一組、第二組、第三組。按照培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法不同分為一號(hào)瓶、二號(hào)瓶。

2.2 制備培養(yǎng)基

3瓶500 mL研發(fā)室自制培養(yǎng)基，標(biāo)記為一號(hào)瓶，進(jìn)行120 ℃滅菌30 min冷卻后放常溫備用。3瓶500 mL肉肝胃酶消化湯半固體西藏生藥廠小培組提供，標(biāo)記為二號(hào)培養(yǎng)基。西藏生藥廠小培組提供培養(yǎng)基加入無(wú)菌新鮮兔肝塊。

2.3 具體試驗(yàn)方法如下

2.3.1 第一組培養(yǎng)方法

第一組一號(hào)瓶接種肉毒梭菌C型1.5%菌液，同時(shí)加入已滅菌0.2%葡萄糖（50%），培養(yǎng)期間進(jìn)行流加方式加入自制的培養(yǎng)基，普通溫箱35 ℃培養(yǎng)7 d。二號(hào)瓶接種肉毒梭菌C型1.5%菌液，同時(shí)加入已滅菌0.2%葡萄糖（50%），普通溫箱35 ℃靜置培養(yǎng)96 h。

2.3.2 第二組培養(yǎng)方法

第二組一號(hào)瓶和二號(hào)瓶培養(yǎng)方法同2.3.1。

2.3.3 第三組培養(yǎng)方法

第三組一號(hào)瓶和二號(hào)瓶培養(yǎng)方法同2.3.1。

2.4 肉毒梭菌c型鑒定

1純粹檢驗(yàn)：取第一組一號(hào)瓶和二號(hào)瓶肉毒梭菌C型種子，分別在TG小管、厭氣肉肝湯小管、GA小管培養(yǎng)基上接種，每種培養(yǎng)基接種2支，每支劑量為0.2 mL，其中1支在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，另一只培養(yǎng)溫度為25 ℃。觀察3 d，檢驗(yàn)結(jié)果為純粹，符合獸藥典的要求[2]。②培養(yǎng)特性：本菌為嚴(yán)格的厭氧菌，在肉肝胃酶消化湯半固體培養(yǎng)基中呈中等生長(zhǎng)，在厭氣肉肝湯中生長(zhǎng)不良或不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基加入新鮮生肝塊時(shí)，生長(zhǎng)良好，產(chǎn)氣，有臭味。取第一組一號(hào)瓶和二號(hào)瓶肉毒梭菌C株種子，在鮮血瓊脂平板上厭氣條件下，37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落為不規(guī)則的圓形，直徑3 mm左右，半透明，邊緣不整齊，有略大于菌落的溶血圈。培養(yǎng)結(jié)果符合獸藥典要求。

2.5 毒力試驗(yàn)

取樣測(cè)定菌液上清毒素含量；用明膠磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，分別稀釋如下表1～3，每個(gè)稀釋度尾靜脈注射3只14～16 g小鼠，0.2 mL/只，連續(xù)觀察3 d并記錄小鼠死亡情況。

表1 第一組

3 結(jié)果

3.1 三組結(jié)果

表2 第二組

表3 第三組

各組小鼠死亡結(jié)果看出，對(duì)培養(yǎng)和培養(yǎng)方法改進(jìn)后收獲的肉毒梭菌C型種子毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于改進(jìn)前培養(yǎng)方法取得種子毒力。

3.2 鏡檢結(jié)果

肉毒梭菌屬于厭氣性梭狀芽孢桿菌屬，C型肉毒毒素在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上常見(jiàn)略帶黃色的中心，表面一般比較光滑，也有呈顆粒狀的。在較濕潤(rùn)的平板上易生產(chǎn)成片狀[3]。血平板上比較大的β溶血環(huán)。C型肉毒毒素的形態(tài)一般粗大桿菌，約為4×1 μm的大桿菌，一般單個(gè)存在，偶見(jiàn)成雙或短鏈，兩端平行，兩端鈍圓、直桿狀或稍微彎曲，有4～8根周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)遲緩，無(wú)莢膜，芽孢為卵圓型，位于次極端，使菌體呈鑰匙形狀或者網(wǎng)球拍形狀，偶有位于中央，常見(jiàn)很多游離芽孢。革蘭氏染色陽(yáng)性。

4 討論

4.1 簡(jiǎn)化操作方法

通過(guò)本次試驗(yàn)對(duì)肉毒梭菌C型培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法改進(jìn)后得到菌液測(cè)定毒力結(jié)果能看出，我們自制的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法是對(duì)的，對(duì)比常規(guī)培養(yǎng)法既提高了毒價(jià)，又簡(jiǎn)化了添加新鮮肝子繁瑣程序。

4.2 降低成本

肉肝胃酶消化湯半固體培養(yǎng)基制備繁瑣，成本高，而我廠研發(fā)室自制的培養(yǎng)基是干粉培養(yǎng)基，制備簡(jiǎn)單，成本低。該操作方法無(wú)需加入新鮮肝塊，減少了種子用量，細(xì)菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒具有較高的穩(wěn)定性，細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程同時(shí)也是毒素的純化過(guò)程，工序簡(jiǎn)單，有效解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺陷。

4.3 為我廠實(shí)施新版《獸藥質(zhì)量管理規(guī)范》打下理論基礎(chǔ)

2020年6月1日起，所有獸藥生產(chǎn)企業(yè)要執(zhí)行新版《獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2020年修訂）》，目前西藏生藥廠生產(chǎn)C型肉毒梭菌滅活疫苗，仍以常法生產(chǎn)，存在著不易生長(zhǎng)、產(chǎn)毒能力低、抗原純度差、免疫計(jì)量大等問(wèn)題。這次通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法不僅為我廠更好執(zhí)行新版獸藥要求，（對(duì)肉毒梭菌C型發(fā)酵罐進(jìn)行縮小）打下理論基礎(chǔ)，也更為西藏畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展添磚加瓦。