周婷婷,沈衛(wèi)星,2,陳桐慶,馮慧,譚佳妮,2,徐長(zhǎng)亮,2,余成濤,2,范旻旻,2,程海波,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

結(jié)直腸癌是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤,對(duì)社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)[1]。奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)是第3代鉑類藥物,臨床常用于結(jié)直腸癌的治療。患者常在用藥24～48 h內(nèi)出現(xiàn)急性神經(jīng)毒性,長(zhǎng)期劑量累積會(huì)引起慢性神經(jīng)毒性。若OXA用藥累積劑量超過1 165 mg·m-2,大約有50%的患者會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng),如肢端感覺麻木、鈍痛等,從而導(dǎo)致化療中止,最終影響療效[2～3]。OXA神經(jīng)毒性的產(chǎn)生與藥物劑量累積效應(yīng)呈正相關(guān),此類周圍神經(jīng)毒性被稱為蓄積性周圍神經(jīng)毒性[4]。臨床研究表明,接受含OXA化療方案的惡性腫瘤患者中蓄積性周圍神經(jīng)毒性發(fā)生率高達(dá)60%～90%,不僅影響患者化療耐受性、依從性及臨床療效,還嚴(yán)重影響患者精神心理健康和生存質(zhì)量[5]。因此,如何有效防治含有OXA化療方案造成的周圍神經(jīng)毒性,減輕周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷已成為臨床迫切需要解決的問題。

探索一種新的化療增效藥物,在保持或增加化療效果的前提下,降低OXA使用劑量,或縮短化療周期,對(duì)減輕OXA所致的蓄積性周圍神經(jīng)毒性具有重要意義。近年來,中醫(yī)藥已廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床治療?，F(xiàn)代藥理研究表明,預(yù)知子包含有三萜類及皂苷類等成分,具有抗腫瘤的作用[6-7],但對(duì)預(yù)知子中的成分是否可增效OXA尚未有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象,探索預(yù)知子提取物增敏OXA的最佳組合濃度,在保證抗腫瘤藥效的前提下,減少OXA的使用劑量,并初步探討其作用機(jī)制,為OXA治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞由國(guó)家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗(yàn)方評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)研究室提供。

1.2 試劑

預(yù)知子(河北福君堂藥業(yè)有限公司，批號(hào):190505,產(chǎn)地:河北);OXA(美國(guó)MCE公司,貨號(hào):HY-17371);皂苷B(實(shí)驗(yàn)室自制,純度>98%);α-常春藤皂苷(成都瑞芬思生物科技有限公司,貨號(hào):27013-91-8);噻唑藍(lán)(德國(guó)Biofroxx公司,貨號(hào):298-93-1);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):KGA107);Cleaved caspase-3抗體(美國(guó)Affinity公司,貨號(hào):AF7022);Caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyt-c抗體(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):AB13847、AB196495、AB5714、AB133504);p-p38 MAPK、p38 MAPK、抗兔IgG、抗鼠IgG抗體(美國(guó)CST公司,貨號(hào):4511T、8690T、7074、7076);GAPDH抗體(美國(guó)Immuno way公司,貨號(hào):YM3029);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0013D)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(瑞士Roche公司,貨號(hào):11697498001、4906845001)。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC系統(tǒng)、Xevo TQ檢測(cè)器、MassLynx4.1質(zhì)譜工作站(美國(guó)Waters公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司,型號(hào):ELx80);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司,型號(hào):EPICS XL-MCL ADC);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):1645050);化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀器(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon 5500)。

2 方法

2.1 預(yù)知子乙酸乙酯萃取物的制備

將10 kg預(yù)知子用無水乙醇浸泡3次,第1次7 d,第2次5 d,第3次3 d。合并浸出液過濾后,減壓回收溶劑得粗浸膏。將粗浸膏分散于5 L純水中,用不同極性的溶劑石油醚、乙酸乙酯依次萃取3次,將乙酸乙酯萃取層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,最終得到乙酸乙酯部位干凈粉末161.5 g。

2.2 預(yù)知子提取物樣品活性部位的篩選分離及鑒定

將乙酸乙酯部位161.5 g以硅膠(200～300目)干法拌樣,進(jìn)行中壓柱層析(200～300目)分離,用石油醚-乙酸乙酯作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(純石油醚→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→純乙酸乙酯),得到18個(gè)餾分,記為1～18。將16餾分12.84 g以反相硅膠(C18)干法拌樣,進(jìn)行低壓柱層析(C18)分離,以TLC檢測(cè),合并相同的餾分,最后得到25個(gè)餾分,記為B1～B25。以對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率為效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,確定B14組分為活性部位[8]。

取B14提取物200 mg,以甲醇/水(1∶1)溶解,制備液相分離。使用HPLC進(jìn)行分離,色譜柱為Waters X-Bridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),保護(hù)柱為Phenomenex Widepore C18(4 mm×3 mm),流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),時(shí)長(zhǎng)50 min。梯度洗脫程序:0～50 min,40%A;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為1 mL·min-1;柱溫為26 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物溶解

HCT116細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將B14用DMSO溶解,以DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度,對(duì)照組含相應(yīng)濃度的DMSO而不含B14。將OXA用雙蒸水溶解,以DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

2.4.1 B14對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用 將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,設(shè)不同濃度B14組(0、2、4、6、8、16、32 μg·mL-1),設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,37 ℃避光4 h,每孔加150 μL DMSO振蕩10 min,測(cè)定490 nm處光密度值(OD),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD給藥組/OD對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4.2 B14增敏OXA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用 將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,B14組設(shè)濃度(0、3、6、12、24、32 μg·mL-1),OXA組設(shè)濃度(0、7.5、15、25、40、80 μg·mL-1),孵育時(shí)間為24 h,均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)方法同“2.4.1”。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用CompuSyn軟件分析兩藥聯(lián)合效應(yīng),并采用中位數(shù)效應(yīng)原理確定復(fù)合指數(shù)(CI)值。CI=D1/Dx1+D2/Dx2,其中,D1和D2分別表示B14和OXA聯(lián)合使用產(chǎn)生同等效果所需的劑量,Dx1和Dx2分別表示抑制一定水平細(xì)胞生長(zhǎng)所需的B14和OXA游離藥物劑量。CI<1表示兩藥聯(lián)用為協(xié)同效應(yīng),CI=1為相加作用,CI>1為拮抗作用。

根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和軟件分析結(jié)果,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定聯(lián)合用藥最佳藥物量效比濃度。

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。根據(jù)“2.4.2”實(shí)驗(yàn)中軟件分析得到的最佳量效濃度,將細(xì)胞分為對(duì)照組、B14組(6 μg·mL-1)、OXA組(15 μg·mL-1)和聯(lián)合組(6 μg·mL-1B14+15 μg·mL-1OXA)。給藥作用24 h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,分組同“2.5”。加藥培養(yǎng)24 h后,消化、離心收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明操作,避光室溫孵育15 min后,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,分組同“2.5”。細(xì)胞貼壁后,換不含血清的DMEM培養(yǎng)液,饑餓細(xì)胞24 h使細(xì)胞周期同步化。加藥培養(yǎng)24 h后,消化、離心收集細(xì)胞,加入10 mL預(yù)冷的70%乙醇,-20 ℃固定過夜。固定結(jié)束后,用預(yù)冷的PBS洗2遍,再用碘化丙啶(PI)染色,避光、室溫反應(yīng)10 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)24 h后,移去上清,PBS洗3次后吸除,加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,提取細(xì)胞總蛋白。BCA法定量蛋白,將各組蛋白濃度調(diào)整一致,加入適量4×蛋白上樣緩沖液,100 ℃沸水浴10 min,冷卻備用。SDS-PAGE凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉常溫封閉2 h。依次加入PBST稀釋的一抗(Bcl-2 1∶2 000;Bax 1∶1 000;Cyt-c 1∶5 000;Cleaved caspase-3 1∶1 000;Caspase-3 1∶5 000;p-p38 MAPK 1∶1 000;p38 MAPK 1∶1 000),4 ℃孵育過夜,PBST洗3次,每次10 min。二抗用PBST稀釋至1∶5 000,室溫下孵育2 h。洗膜后顯色、曝光、拍照,用Image J分析各條帶光密度值,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 預(yù)知子活性部位B14的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》[9],結(jié)合HPLC的檢測(cè)結(jié)果(圖1～2),初步分析預(yù)知子活性部位B14的主要成分為皂苷B和α-常春藤皂苷。圖2中1號(hào)峰保留時(shí)間為35 min左右,鑒定為皂苷B,全稱:3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin[10-11];2號(hào)峰保留時(shí)間為37 min左右,鑒定為α-常春藤皂苷,全稱:3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin[12]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of standard products

注：1.皂苷B；2.α-常春藤皂苷?qǐng)D2 B14的HPLC圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of B14

3.2 B14與OXA對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用

B14能抑制HCT116細(xì)胞增殖,IC50為18.6 μg·mL-1,且抑制作用呈時(shí)間與劑量依賴性,見圖3。通過表1分析,聯(lián)合組的抑制作用強(qiáng)于單藥組。6 μg·mL-1B14對(duì)HCT116細(xì)胞無明顯毒性,但與OXA 7.5、15、25、40、80 μg·mL-1聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其抑制率比單獨(dú)使用OXA顯著提高(P<0.001)。

圖3 B14對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的作用Fig.3 The effect of B14 on HCT116 cells proliferation

表1 各組HCT116細(xì)胞增殖抑制率的比較Table 1 Comparison of inhibitory rates of HCT116 cells proliferation in each group

3.3 聯(lián)合用藥藥效評(píng)價(jià)

將B14聯(lián)合OXA的不同濃度(3+7.5、6+15、12+25、24+40、32+80 μg·mL-1)抑制率數(shù)據(jù)輸入CompuSyn軟件生成圖4。提示本研究所選擇的藥物濃度配比中,6 μg·mL-1B14+15 μg·mL-1OXA方案CI值最小,協(xié)同作用最強(qiáng),為最佳配比,故作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

圖4 不同濃度B14+OXA抑制HCT116細(xì)胞增殖的聯(lián)合指數(shù)圖Fig.4 Fa-CI plot of HCT116 cells proliferation inhibition with different concentrations of B14+OXA

3.4 B14與OXA對(duì)HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。B14組與OXA組細(xì)胞密度降低,細(xì)胞狀態(tài)變差。聯(lián)合組相鄰細(xì)胞連接疏松,細(xì)胞增殖減少且形態(tài)發(fā)生明顯變化,出現(xiàn)細(xì)胞變圓皺縮等現(xiàn)象,見圖5。

A.空白組;B.B14組;C.OXA組;D.聯(lián)合組圖5 各組HCT116細(xì)胞形態(tài)比較(×100)Fig.5 HCT116 cell morphology in each group (×100)

3.5 B14與OXA對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較,B14組凋亡率有輕度升高,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OXA組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.01),但聯(lián)合組具有顯著誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡的作用,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖6。

注：與對(duì)照組比較,圖6 各組HCT116細(xì)胞凋亡的比較Fig.6 The apoptosis rates of HCT116 cells in each group

3.6 B14與OXA對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較,OXA組和聯(lián)合組HCT116細(xì)胞明顯被阻滯于G2/M期,S期細(xì)胞減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖7。

3.7 B14與OXA對(duì)HCT116細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，OXA組和聯(lián)合組HCT116細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01，P<0.001)，Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-3/Caspase-3比值及p-p38 MAPK顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。與OXA組比較，聯(lián)合組Bcl-2、Caspase-3及Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01，P<0.001)，Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-3/Caspase-3比值及p-p38 MAPK顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001),見圖8。

注：與對(duì)照組比較,圖7 各組HCT116細(xì)胞周期的比較Fig.7 The cycle distribution of HCT116 cells in each group

注:A.對(duì)照組;B.B14組;C.OXA組;D.聯(lián)合組;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與OXA組比較,圖8 各組p38 MAPK信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.8 The expressions of p38 MAPK signal pathway and apoptosis related proteins in each group

4 討論

結(jié)直腸癌常由致癌因子引起細(xì)胞無限增殖,治療的關(guān)鍵是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。OXA常用于治療Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌,其抗腫瘤作用顯著,但也常引起骨髓抑制、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng),降低患者生活質(zhì)量,影響臨床化療效果。OXA毒副作用的產(chǎn)生與劑量累積密切相關(guān)[14]。近年來,基于增效減毒目的的OXA與其他藥物聯(lián)合使用的臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明,在不影響OXA抗腫瘤療效的前提下,降低OXA的使用量是減少其毒副作用的可能途徑之一。肖海娟等[15]研究發(fā)現(xiàn),腸胃清粗提物協(xié)同增效OXA對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的化療敏感性。馮杰等[16]研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素B促進(jìn)Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá),抑制Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá),誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡,與OXA聯(lián)合后抑制作用更顯著。

研究表明,預(yù)知子是中醫(yī)治療腫瘤行氣活血治法的代表藥,對(duì)肝癌、大腸癌、胃癌等具有抑制作用,但研究成果主要集中在臨床經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)研究中,預(yù)知子抗腫瘤的機(jī)制研究仍有相當(dāng)大的空間。吳曉等[17]研究發(fā)現(xiàn),預(yù)知子醇提物協(xié)同雷公藤紅素具有顯著抑制SMMC7721細(xì)胞增殖及凋亡的作用,其機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬有關(guān)。張瑜等[18]研究發(fā)現(xiàn),預(yù)知子醇提物可抑制H22細(xì)胞小鼠移植瘤的生長(zhǎng),減輕化療的毒副作用。

根據(jù)本研究HPLC圖顯示，通過與對(duì)照品比對(duì)，乙腈溶劑峰對(duì)皂苷B和α-常春藤皂苷的峰沒有影響；對(duì)照品與B14樣品溶液中的皂苷B和α-常春藤皂苷的保留時(shí)間基本相同，RSD值均小于2.0%，故該色譜條件適合作為B14定性的HPLC色譜條件，預(yù)知子的抗腫瘤活性部位B14的主要成分為皂苷B和α-常春藤皂苷。MTT結(jié)果提示，聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于B14單藥組(P<0.001)或OXA單藥組(P<0.05，P<0.001),提示B14可以增強(qiáng)HCT116細(xì)胞對(duì)OXA的化療敏感性。CompuSyn結(jié)果提示,B14與OXA聯(lián)合可能存在最佳抑制效果的濃度配比,即濃度分別為6 μg·mL-1和15 μg·mL-1。B14促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用并不顯著,但可以顯著增加OXA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.001)。與對(duì)照組比較,聯(lián)合組和OXA組細(xì)胞G2/M期比例明顯升高,S期細(xì)胞百分率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),說明聯(lián)合組和OXA組將HCT116細(xì)胞阻滯在了G2/M期。

既往研究表明,p38 MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。一旦腫瘤形成,p38 MAPK常處于低活化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低劑量6 μg·mL-1B14聯(lián)合OXA可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,激活p38 MAPK磷酸化,可能與介導(dǎo)Bax釋放至線粒體膜上,破壞膜內(nèi)外離子濃度差,進(jìn)而使Cyt-c釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活Caspase-3,引發(fā)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]相關(guān)。Bcl-2/Bax是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路,其中Bcl-2是抗凋亡因子,Bax是促凋亡因子[20]。二者結(jié)合后可以激活Caspase-3途徑,加速結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[21]。Cleaved caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的核心因子,也是預(yù)知子治療腫瘤的潛在靶點(diǎn),通過活化Caspase-3,激活級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。因此,B14可能成為一種潛在的OXA化療增敏劑,可降低OXA的使用量,進(jìn)一步限制其副作用。

綜上所述,預(yù)知子提取物B14可增加結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的OXA化療敏感性,這種作用可能與阻滯細(xì)胞周期在G2/M期及激活p38 MAPK介導(dǎo)的線粒體凋亡通路有關(guān)。本研究結(jié)果為臨床減輕OXA毒副作用、提高化療療效提供了方向和線索。同時(shí),由于B14是包含2種成分的混合物,其確切的增敏OXA的活性成分及機(jī)制將在今后進(jìn)行深入研究。