王春枝 武百強 吳 威 趙艷庚 張 娜 唐海霞 楊冬松

（漯河醫(yī)學高等?？茖W校第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，漯河 462300）

膿毒癥是指由各種病原微生物感染引起的全身炎癥反應綜合征，其特點是機體不受控制的感染反應導致危及生命的器官功能障礙［1-2］。盡管膿毒癥的病理機制尚不清楚，但炎癥級聯(lián)進展和各種促炎遞質釋放已被證明參與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展［3-4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200個核苷酸且不具備蛋白編碼能力的RNA 分子，在多種生物學過程中發(fā)揮調節(jié)作用。lncRNA FGD5-AS1 是一種新型lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)，在IL-1β 誘導的關節(jié)軟骨細胞損傷中，lncRNA FGD5-AS1 負調控miR-103a-3p 抑制細胞凋亡和炎癥反應［5］。lncRNA FGD5-AS1 通過 miR-223/IGF1R軸減輕氧糖剝奪/再灌注（OGD/R）誘導的大鼠神經(jīng)元損傷［6］。過表達lncRNA FGD5-AS1顯著緩解脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的人牙周膜細胞（periodontal ligament cells，PDLCs）損傷［7］。但lncRNA FGD5-AS1 在膿毒癥誘導的細胞損傷中的作用尚不清楚。本實驗通過StarBase 預測發(fā)現(xiàn)lncRNA FGD5-AS1 與miR-15a-5p 具有結合位點。有研究報道m(xù)iR-15a 能夠通過靶向BDNF 調節(jié)OGD/R 誘導的大鼠 神經(jīng) 損傷［8］。抑 制 miR-15a-5p 靶向 負 調 控TNIP2 表達能夠減輕LPS 誘導的小鼠巨噬細胞炎癥反應［9］。盡管已有研究確定 miR-15a-5p 在 LPS 誘導的膿毒癥炎癥反應中的作用，但lncRNA FGD5-AS1在膿毒癥炎癥中的作用及其機制是否與miR-15a-5p有關尚未可知。因此，本實驗旨在研究lncRNA FGD5-AS1 是否通過靶向調控miR-15a-5p 表達影響膿毒癥炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1細胞系（人髓系白血病單核細胞系）購自中國科學院細胞庫（中國上海）；細胞在5%CO2和37 ℃環(huán)境中孵育，培養(yǎng)基采用含10%FBS的 DMEM 完全培養(yǎng)基［10］；LPS 購自美國 Sigma 公司；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA 試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購自北京天根生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國 Invitrogen 公司；RT-qPCR 轉染引物由上海生工生物工程公司合成；FGD5-AS1 野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1 由上海基因制藥有限公司設計。

1.2 方法

1.2.1 LPS 處理與分組 將對數(shù)生長期的THP-1細胞調整濃度至 5.0×106個/ml，500 ng/ml LPS 刺激4 h，建立膿毒癥模型，記為LPS組［11］。THP-1生長至70%~80%融合時，按照Lipofectamine2000 說明書，將 pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、si-NC、si-FGD5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-15a-5p分別轉染至LPS組，記為pcDNA 組、pcDNA-FGD5-AS1 組、si-NC 組、si-FGD5-AS1 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-15a-5p 組；pcDNAFGD5-AS1 分 別 與 miR-NC、miR-15a-5p 共 轉 染 至LPS 組，記為 pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC 組、pcDNAFGD5-AS1+miR-15a-5p組，48 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR 提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，lncRNA FGD5-AS1 和 miR-15a-5p 分 別 以GAPDH和U6為內參，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，檢測各組lncRNA FGD5-AS1 和miR-15a-5p 水平以驗證轉染效果。lncRNA FGD5-AS1 正向引物序列：5'-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3'，反向引物序列：5'-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3'；miR-15a-5p 正向引物序列：5'-GGGTAGCAGCACATAATGGTT-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，反向引物序列：5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'；U6 正向引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.2.3 Annexin V 檢測細胞凋亡 按照ANXA5/Annexin凋亡檢測試劑盒說明檢測THP-1細胞凋亡，收集細胞并用PBS 漂洗，195μl結合緩沖液重懸后，加入 5 μl ANXA5-FITC 原液、10 μl 碘化丙啶 37 ℃孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 Western blot 法檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量 60 μg，SDS-PAGE 后轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次，加入二抗室溫孵育 2 h，PBS 洗滌 3 次，暗室中曝光顯影，定影，采用Quantity One 軟件檢測各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH 條帶比值作為蛋白表達水平。

1.2.5 ELISA檢測炎癥細胞因子水平 按照ELISA試劑盒說明檢測THP-1 細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β和TNF-α 表達水平。酶標儀檢測450 nm 處吸光度，計算IL-6、IL-1β和TNF-α濃度。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA FGD5-AS1 和 miR-15a-5p 的靶向關系 FGD5-AS1 野 生 型和突變型熒光素酶表達載體WT-FGD5-AS1和MUTFGD5-AS1 分 別 與 miR-NC 和 miR-15a-5p 共 轉 染 至LPS 誘導的 THP-1 細胞中，48 h 后收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA FGD5-AS1 和 miR-15a-5p 在 LPS 誘 導的THP-1 細胞中的表達 與對照組比較，LPS 誘導的THP-1 細胞中FGD5-AS1 表達降低，miR-15a-5p表達升高（P＜0.05），見表1。

表1 lncRNA FGD5-AS1 和 miR-15a-5p 在 LPS 誘 導 的THP-1細胞中的表達（，n=30）Tab.1 Expressions of lncRNA FGD5-AS1 and miR-15a-5p in LPS induced THP-1 cells（，n=30）

表1 lncRNA FGD5-AS1 和 miR-15a-5p 在 LPS 誘 導 的THP-1細胞中的表達（，n=30）Tab.1 Expressions of lncRNA FGD5-AS1 and miR-15a-5p in LPS induced THP-1 cells（，n=30）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05.

miR-15a-5p 0.99±0.03 4.19±0.221）14.326 0.000 Groups Control LPS t P FGD5-AS1 1.01±0.02 0.46±0.041）12.766 0.000

2.2 過表達lncRNA FGD5-AS1 對LPS 誘導THP-1細胞損傷的影響 如圖1、表2所示，與對照組比較，LPS 組FGD5-AS1 表達降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達降低，Bax表達升高，炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNAFGD5-AS1 組FGD5-AS1 表達升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達升高，Bax表達降低，炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 過表達 lncRNA FGD5-AS1 對 LPS 誘導 THP-1 細胞損傷的影響Fig.1 Effects of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cell injury

表2 過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.2 Effects of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cells（，n=9）

表2 過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.2 Effects of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cells（，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with pcDNA group，2）P＜0.05.

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2.3 lncRNA FGD5-AS1 靶 向 調 控 miR-15a-5p 表達 StarBase 預測顯示lncRNA FGD5-AS1 的序列中含有與miR-15a-5p 互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與轉染miR-NC 的WT-FGD5-AS1比較，轉染miR-15a-5p的熒光素酶活性降低（P＜0.05），而轉染 miR-NC 和miR-15a-5p 的MUT-FGD5-AS1 中，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 3。與 pcDNA 組比較，pcDNAFGD5-AS1 組的 miR-15a-5p 表達降低（P＜0.05）；與si-NC 組比較，si-FGD5-AS1 組 miR-15a-5p 表達升高（P＜0.05），見表4。

表4 lncRNA FGD5-AS1調控miR-15a-5p表達（，n=9）Tab.4 lncRNA FGD5-AS1 regulates miR-15a-5p expression（，n=9）

表4 lncRNA FGD5-AS1調控miR-15a-5p表達（，n=9）Tab.4 lncRNA FGD5-AS1 regulates miR-15a-5p expression（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

miR-15a-5p 1.01±0.04 0.45±0.031）0.98±0.05 2.93±0.182）131.637 0.000 Groups pcDNA pcDNA-FGD5-AS1 si-NC si-FGD5-AS1 F P

圖2 lncRNA FGD5-AS1靶向調控miR-15a-5p表達Fig.2 lncRNA FGD5-AS1 tageting regulates expression of miR-15a-5p

表3 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MUT-FGD5-AS1 0.98±0.04 1.02±0.05 0.765 0.487 Groups miR-NC miR-15a-5p t P WT-FGD5-AS1 1.01±0.04 0.38±0.021）14.246 0.000

2.4 下調 miR-15a-5p 對 LPS 誘導的 THP-1 細胞損傷的影響 與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-15a-5p組miR-15a-5p表達降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達升高，Bax表達降低，炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），見表5、圖3。

表5 下調miR-15a-5p對LPS誘導THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.5 Effects of down-regulating miR-15a-5p on LPS induced THP-1 cell injury（，n=9）

表5 下調miR-15a-5p對LPS誘導THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.5 Effects of down-regulating miR-15a-5p on LPS induced THP-1 cell injury（，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

TNF-α/（pg·ml-1）204.85±6.57 117.53±3.051）12.053 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-15a-5p F P miR-15a-5p 1.02±0.04 0.37±0.021）15.502 0.000 Apoptosis rate/%22.21±1.04 10.49±0.291）10.841 0.000 Bcl-2 0.20±0.01 0.49±0.021）14.113 0.000 Bax 0.67±0.03 0.32±0.011）10.947 0.000 IL-6/（pg·ml-1）111.13±4.99 53.47±2.081）10.668 0.000 IL-1β/（pg·ml-1）128.27±4.73 69.15±2.341）11.205 0.000

圖3 下調miR-15a-5p表達對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響Fig.3 Effects of down-regulating miR-15a-5p on LPS induced THP-1 cell injury

2.5 上調miR-15a-5p 可逆轉過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響 與pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-FGD5-AS1+miR-15a-5p 組miR-15a-5p 表達升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2 表達降低，Bax 表達升高，炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 上調miR-15a-5p 表達能逆轉過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS的誘導THP-1細胞損傷的影響Fig.4 Up-regulating miR-15a-5p can reverse effect of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cell injury

表6 上調miR-15a-5p表達能逆轉過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.6 Up-regulating miR-15a-5p can reverse effects of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cell injury（，n=9）

表6 上調miR-15a-5p表達能逆轉過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞損傷的影響（，n=9）Tab.6 Up-regulating miR-15a-5p can reverse effects of lncRNA FGD5-AS1 overexpression on LPS induced THP-1 cell injury（，n=9）

Note：Compared with pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-15a-5p Bcl-2Bax IL-6/（pg·ml-1）IL-1β/（pg·ml-1）TNF-α/（pg·ml-1）105.11±2.35 172.53±5.171）11.687 0.000 pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC pcDNA-FGD5-AS1+miR-15a-5p F P 0.98±0.03 1.83±0.061）13.564 0.000 Apoptosis rate/%9.22±0.22 16.87±0.841）8.796 0.001 0.51±0.02 0.32±0.011）7.884 0.001 0.28±0.01 0.43±0.021）7.028 0.002 56.29±1.11 91.31±2.691）12.030 0.000 68.77±1.29 109.86±3.111）12.188 0.000

3 討論

膿毒癥是嚴重感染后由多種先天免疫細胞（包括中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞）介導的全身炎癥反應［12］。研究發(fā)現(xiàn)，免疫應答和炎癥反應在膿毒癥發(fā)病機制中起關鍵作用，人體免疫細胞被病原微生物和毒素激活，產生多種炎癥細胞因子，導致嚴重的細胞損傷、微循環(huán)障礙和器官功能障礙［13-15］。已有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 異常表達參與多種炎癥相關疾?。?6-17］。 lncRNA MALAT1 通過 miR-214/TLR5 治療燒傷患者的膿毒癥［18］；lncRNA CRNDE 通過 miR-181a-5p/TLR4 軸參與加重膿毒癥炎癥過程［19］；沉默lncRNA XIST 通過抑制BRD4 表達預防膿毒癥誘導的 急 性 肝 損 傷［20］；lncRNA H19 可 通 過 miR-874/AQP1 顯著逆轉LPS 誘導的炎癥反應和心肌功能障礙［21］。多項研究表明，miRNAs 通過影響重要的信號元件參與膿毒癥誘導的炎癥反應。上調miR-130b表達抑制LPS誘導的膿毒癥模型小鼠的嚴重肺部炎癥；過表達miR-129-5p可通過靶向HMGB1減輕膿毒癥誘導的急性肺損傷；miR-21-3p在LPS誘導的心功能障礙中顯著升高，miR-21-3p 通過SORBS2 調控膿毒癥相關的心臟功能異常；miR-22-3p 通過靶向PTEN抑制膿毒癥誘導的急性腎損傷［22-25］。

本研究顯示，經(jīng)LPS 誘導的THP-1 細胞中，lncRNA FGD5-AS1 表達下調，過表達lncRNA FGD5-AS1 抑制細胞凋亡以及炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達，提示過表達 lncRNA FGD5-AS1 可減輕LPS誘導的細胞損傷。研究表明，lncRNA FGD5-AS1可作為競爭性內源RNA 負調控miRNA 表達緩解細胞 損 傷［5-7］。 本 研 究 StarBase 預 測 顯 示 lncRNA FGD5-AS1 序列中含有與miR-15a-5p 互補的核苷酸序列，雙熒光素酶報告實驗結果證實lncRNA FGD5-AS1靶向調控miR-15a-5p表達。下調miR-15a-5p表達亦可抑制細胞凋亡以及炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達，提示下調miR-15a-5p表達可緩解LPS 誘導的細胞損傷。而上調miR-15a-5p表達可逆轉過表達lncRNA FGD5-AS1對LPS誘導的THP-1細胞凋亡以及炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的影響。

綜上所述，過表達lncRNA FGD5-AS1 可通過靶向下調miR-15a-5p表達減輕LPS誘導的THP-1細胞損傷。