郭譯濛 周明明 郭晉榮 慕珍珍 徐媛媛 耿 龍 （中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001）

銀屑病是一種免疫介導的以紅斑、鱗屑為主要臨床表現的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，其主要病理表現為角質形成細胞異常增殖和炎癥細胞浸潤，全球患病率為2%~5%，嚴重影響患者生活質量和心理狀態(tài)［1-2］。研究表明絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路參與角質形成細胞增殖、分化及凋亡，其中p38 MAPK 信號通路與炎癥關系最為密切，在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，且活化的MAPK 信號通路可促進炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 等釋放，提高銀屑病患者皮損嚴重程度［3-5］。

紫草素是從中國傳統(tǒng)中藥“紫草”根莖中提取的一種萘醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及促進傷口愈合等作用［6-7］。越來越多證據表明，中藥對銀屑病均有較為顯著的治療效果［8］。研究發(fā)現紫草素可通過作用于MAPK 信號通路調節(jié)炎癥反應，減輕D-半乳糖誘導的神經炎癥［9］。課題組前期研究表明，紫草素可通過抑制角質形成細胞增殖和誘導其凋亡治療銀屑?。?0］?；谝陨涎芯勘尘?，本研究建立咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型，旨在從p38 MAPK 信號通路角度探索紫草素對銀屑病的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級6~8 周齡雄性BALB/c小鼠，體質量16~20 g，均購自遼寧長生生物科技有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

1.1.2 主要試劑 紫草素購自南京廣潤生物制品有限公司；5%咪喹莫特乳膏（Imiquimod，IMQ）購自四川明欣藥業(yè)有限責任公司；Anti-p38 抗體購自美國 Abcam 公司；p-p38 抗體購自美國 CST 公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 低溫超速離心機、Fast Real-time PCR儀購自美國Thermo 公司；酶標儀購自美國Bio-Tek公司；自動切片機購自德國Leica 公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組與處理 6~8周齡BALB/c雄性小鼠剔除背部正中毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，備皮后隨機分為5組：空白對照組（CON）、咪喹莫特模型組（IMQ）、紫草素低［5 mg/（kg·d）］、中［7.5 mg/（kg·d）］和高劑量組［10 mg/（kg·d）］。處理組小鼠給予5%IMQ乳膏（62.5 mg/只），1 次/d，連續(xù)7 d 建立銀屑病樣小鼠模型，對照組給予等劑量凡士林。將紫草素溶于食用油后灌胃給予相應處理組小鼠，同時對照組和模型組給予食用油［1 mg（/kg·d），含5%DMSO 的食用油］。小鼠每日給藥前拍照、稱重，觀察并記錄小鼠背部皮損動態(tài)變化。

1.2.2 小鼠銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）評分 按照PASI 評分從鱗屑、紅斑、增厚程度三個方面對小鼠背部皮損嚴重程度進行評分（0 分：無皮損；1 分：輕度皮損；2 分：中度皮損；3 分：重度皮損；4 分：極重度皮損），三者分數相加即為累積分數，記錄并繪制評分趨勢圖。

1.2.3 小鼠皮損HE染色 第8天以頸脫位法處死小鼠，留取相應皮損組織固定于10%中性甲醇中，脫水、石蠟包埋，制備5μm 切片并進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察皮損組織病理學改變。

1.2.4 Western blot 檢測皮損中p-p38 蛋白表達研磨組織后加入適量含蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、15 000 r/min 離心15 min，收集上清，分裝，BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V），200 mA 恒流轉膜40 min，加入快速封閉液室溫封閉15 min，分別加入適量抗p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗稀釋液4 ℃輕搖過夜，洗膜后二抗室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL 化學發(fā)光液曝光顯影，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 免疫組化法檢測皮損組織中p-p38 蛋白表達 制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復，加入 3%H2O2室溫孵育 15 min，PBS 清洗，室溫封閉30 min，加入50μl 1∶100稀釋的p-p38一抗4 ℃避光孵育過夜，復溫45 min 后PBS 清洗，二抗室溫孵育45 min，DAB 顯色，蘇木素復染15 s。光學顯微鏡下隨機選取3個中心視野拍照，Image-Pro6.0軟件進行評估。

1.2.6 qRT-PCR 檢測皮損中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α表達 采用TRIzol 法提取皮損組織總RNA，紫外分光光度計檢測mRNA 濃度，逆轉錄為cDNA，以此為模板采用SYBR Green 法進行PCR 擴增反應。引物序列GAPDH F：5'-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3'，R：5'-CGGCCAAATCCGTTCACACCG-3'；IL-6 F：5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3'，R：5'-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3'；IL-1β F：5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'，R：5'-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3'；TNF-α F：5'-CAGGCGGTGCCTAT-GTCTC-3'，R：5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3'，退火溫度為60 ℃，重復3次，2-ΔΔCt計算。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism7.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素可改善IMQ 誘導的小鼠銀屑病樣皮損 與對照組相比，模型組小鼠背部皮膚第8 天明顯增厚，并出現典型紅斑、鱗屑。紫草素連續(xù)治療7 d后，紫草素治療組小鼠銀屑病樣皮損較模型組顯著改善，紫草素高劑量組改善最為顯著（圖1）。對照組小鼠體質量無明顯變化，模型組和紫草素治療組小鼠體質量較對照組明顯減輕（P＜0.01），且紫草素治療組小鼠體質量變化幅度低于模型組（P＜0.05，圖2A）。PASI 評分趨勢圖可見模型組小鼠于第2 天出現明顯皮損，而后逐漸加重并于第6~7 天達到高峰。第7天時紫草素各治療組紅斑、鱗屑、浸潤程度及總評分與模型組相比顯著降低（P＜0.01），但紫草素中、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2B~E）。

圖1 各組小鼠第8天背部皮損表現Fig.1 Back skin lesions of mice in each group at 8 d

圖2 各組小鼠體質量及皮損PASI評分Fig.2 Body weight and PASI scores of mice skin lesions in each group

2.2 HE 染色觀察各組小鼠組織病理學變化 HE染色顯示對照組小鼠表皮薄，皮下炎癥細胞浸潤少，而模型組小鼠呈現明顯銀屑病樣改變，包括表皮增厚、炎癥細胞浸潤、角化不全伴角化過度，且可見大量Munro 微膿腫，測量結果顯示模型組小鼠背部皮損的垂直表皮厚度約為對照組6.7 倍（P＜0.001）。與模型組相比，紫草素治療組小鼠表皮增厚程度明顯減少，炎癥細胞浸潤及Munro 微膿腫減輕（P＜0.01），但紫草素中、高劑量組小鼠表皮厚度及炎癥細胞浸潤程度無顯著差異（圖3）。表明紫草素可有效抑制IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮炎。

圖3 各組小鼠背部皮膚的組織病理表現（HE，×200）Fig.3 Histomorphology manifestations of back skin of mice in each group（HE，×200）

2.3 紫草素抑制IMQ 誘導的小鼠銀屑病樣皮損中p-p38 蛋白表達 Western blot 結果表明，模型組p38 MAPK 蛋白磷酸化水平較空白對照組顯著升高（P＜0.001）。IMQ誘導的小鼠經紫草素治療后，p-p38蛋白表達隨給藥濃度升高逐漸降低，紫草素低、中、高劑量組p-p38 蛋白表達分別降低89.9%、76.7%和50.3%（P＜0.01，P＜0.001，圖 4）。免疫組化結果顯示，與空白對照組相比，IMQ 誘導的小鼠皮損p-p38 在表皮廣泛表達，呈現明顯親核傾向，呈深棕色（P＜0.001）。與模型組相比，紫草素治療組小鼠皮損組織中p-p38 表達明顯下降，顏色變淺（P＜0.01，P＜0.001，圖5）。

圖4 Western blot 檢測紫草素對p-p38表達的影響Fig.4 Effect of shikonin on expression of p-p38 detected by Western blot

2.4 紫草素降低小鼠背部皮損中IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達 qRT-PCR 檢測小鼠背部皮損中IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達，結果顯示，模型組促炎細胞因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA 水平較對照組顯著升高，分別提高5.5、9.4 和9.4 倍。紫草素處理后，IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA 表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。表明紫草素可能通過抑制p38 MAPK 信號通路調節(jié)下游蛋白及炎癥因子表達，從而改善小鼠銀屑病樣皮膚炎癥。

圖6 紫草素對IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達的影響Fig.6 Effects of shikonin on IL-6，IL-1β and TNF-α mRNA expressions

3 討論

本研究旨在探討紫草素對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的影響及潛在作用機制。局部采用咪喹莫特可使小鼠皮膚發(fā)生銀屑病樣改變，目前已被廣泛用于銀屑病發(fā)病機制研究［11-12］。本實驗選用5%咪喹莫特乳膏誘導銀屑病小鼠模型，結果表明紫草素可有效緩解小鼠皮損紅斑、鱗屑及增厚程度，降低PASI評分，且呈劑量依賴性。HE 染色結果表明紫草素可抑制角質形成細胞角化、減少炎癥細胞浸潤。提示紫草素對小鼠銀屑病樣皮膚炎癥有顯著抑制作用。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）可調節(jié)炎癥級聯(lián)反應，在銀屑病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。MAPK家族包括細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-JunN 末端激酶（JNK）和p38［13］。研究發(fā)現 MAPK 被激活后易位至細胞核，使多種轉錄因子和靶蛋白磷酸化，從而調節(jié)靶基因轉錄發(fā)揮生物學效應，且p-p38 表達在銀屑病皮損中顯著升高［14-16］。本研究顯示，模型組p-p38 表達顯著升高，給予紫草素可有效抑制小鼠皮損中p-p38表達。同時，SOEGAARD-MADSEN等［17］證明阿達木單抗主要通過抑制p38 活性下調p38 調節(jié)的炎癥因子表達治療銀屑病，與本研究結果一致，表明紫草素可能通過抑制p38 MAPK 信號通路發(fā)揮抗炎作用。

為研究紫草素對銀屑病小鼠模型中促炎細胞因子的影響，采用qRT-PCR 檢測皮膚組織中IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達。大量研究證明 IL-6、IL-1β 和TNF-α 在銀屑病病變組織和血清中高表達，且與疾病嚴重程度密切相關［18-19］。p38 MAPK 被激活后可促進炎癥反應，募集IL-6 等炎癥因子在皮損處聚集形成正反饋，進一步加速疾病發(fā)展［20］。INOUE 等［21］研究發(fā)現紫草素可抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液中IL-6、TNF-α 等炎癥因子分泌。本研究通過對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠研究證明，紫草素同樣可抑制促炎細胞因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA上調。

本研究表明紫草素可改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥，抑制p38 MAPK 磷酸化并下調 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達。綜上所述，紫草素可能通過干預p38 MAPK 信號通路發(fā)揮保護作用，在治療銀屑病方面具有很大潛力，但仍需在臨床樣本上進行進一步研究，以便更完整地探索紫草素的作用，為紫草素治療銀屑病奠定理論基礎。