李 穩(wěn),杜晶晶,牟惠冰,王曉敏,周廣燦，2

(1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院(牡丹學(xué)院)，山東 菏澤 274015; 2.菏澤學(xué)院牡丹研究院，山東 菏澤 274015)

引言

超長鏈脂肪酸(Ultra-Long Chain Unsaturated Fatty Acids)是指主鏈碳原子數(shù)≥18個的脂肪酸，在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用[1].植物中超長鏈脂肪酸是由錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體催化合成.脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體由四種酶組成，其中β-酮酯酰-CoA合酶(β-Ketoacyl-CoA Synthase, KCS)是催化超長鏈脂肪酸碳鏈延長反應(yīng)的限速酶，并控制著合成超長鏈脂肪酸的種類[2-5].編碼β-酮酯酰-CoA合酶的基因家族被命名為KCS基因家族.KCS基因在植物中起源極早，而且從綠藻類植物中的單拷貝狀態(tài)通過基因復(fù)制擴(kuò)張成為被子植物中20～30個成員的基因家族[6].隨著基因的復(fù)制及不同基因拷貝上變異的積累，KCS家族基因成員發(fā)生了功能的分化，表現(xiàn)出合成產(chǎn)物的特異性[7-9]，并且具有組織與器官的表達(dá)特異性[10-11].

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)多年生落葉灌木.作為中國的國花，牡丹既是一種極具觀賞性的花卉，又是一種食材和藥材[12].此外，油用牡丹產(chǎn)油率高，富含亞麻酸、亞油酸和油酸等超長鏈不飽和脂肪酸，是一種優(yōu)質(zhì)的木本油料作物[13-14].目前關(guān)于牡丹中超長鏈脂肪酸合成的研究以及牡丹基因組中KCS家族基因的存在情況及其分子演化特征研究的較少.因此，本文運用基礎(chǔ)生物信息學(xué)的方法，從牡丹基因組中鑒定其編碼的KCS家族基因，分析和預(yù)測KCS基因在牡丹進(jìn)化過程中的演化特征，探討牡丹籽油富含不飽和脂肪酸的分子基礎(chǔ)，為后期油用牡丹的分子遺傳育種提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

在國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(China National GeneBank DataBase, CNGBdb)下載牡丹(Paeoniasuffruticosa)基因組測序、組裝和注釋文件(https://db.cngb.org/search/project/CNP0000281/)[15].

1.2 方法

1.2.1 牡丹KCS基因的鑒定

參考Guo等人[6]的方法鑒定牡丹基因組中KCS基因.鑒定采用基于隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Models)的HMM search和本地BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)兩種方法鑒定牡丹中的KCS基因.首先以Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫中KCS基因的3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C結(jié)構(gòu)域 (Pfam: PF08541)和Type Ⅲ polyketide synthase-like結(jié)構(gòu)域 (Pfam: PF08392)的HMM 模型作為問詢序列，對牡丹基因組中注釋的蛋白序列進(jìn)行第一輪搜索，參數(shù)設(shè)定為程序默認(rèn).同時，使用KCS基因編碼的氨基酸序列對牡丹基因組中注釋的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTp 搜索，E-value設(shè)為1.最后將HMM search和BLAST 方法獲得的序列整合并去除重復(fù)序列后，提交在線Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)進(jìn)一步驗證是否每條序列中都存在3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C結(jié)構(gòu)域和Type Ⅲ polyketide synthase-like結(jié)構(gòu)域(E-value 設(shè)為0.0001).

1.2.2 牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

對獲得的牡丹KCS基因，利用 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對其編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，包括氨基酸長度、分子質(zhì)量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等.

1.2.3 KCS基因序列比對和系統(tǒng)演化樹的構(gòu)建

運用ClustalW軟件，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值對提取得到的氨基酸序列進(jìn)行排序，隨后使用MEGA6.0軟件進(jìn)行手動校正以提高序列文件質(zhì)量.最后使用Phyml程序中Maximum likelihood(ML，最大似然法)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.以擬南芥(Arabidopsis thaliana)的KCS基因為參考序列，構(gòu)建牡丹KCS基因的演化關(guān)系樹.內(nèi)部節(jié)點的可靠性使用SH-aLRT(Shimodaira-Hasegawa approximate likelihood ratio test)計算方法進(jìn)行評估[16].

1.2.4 牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

利用在線軟件https://www.ebi.ac.uk對鑒定的牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)中的3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C結(jié)構(gòu)域和Type Ⅲ polyketide synthase-like結(jié)構(gòu)域分析并記錄它們的大小和位置.通過在線軟件MeMe(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)分析牡丹KCS基因的保守氨基酸基序，參數(shù)預(yù)測數(shù)目設(shè)為10，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，觀察保守基序在 MADS-box 基因上的分布位置.

2 結(jié)果與分析

2.1 KCS基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過HMM和BLASTp搜索在牡丹基因組中共鑒定出13個KCS基因.它們編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目差異較大(見表1)，例如：psu.T.00030776.1中含有274個氨基酸，而psu.T.00028502.1中含有967個氨基酸.在這13個KCS基因編碼的蛋白質(zhì)中，psu.T.00023496.1的等電點最低(5.63)，其余編碼蛋白質(zhì)的等電點較高，其中psu.T.00007518.1的最高為9.52.psu.T.00007518.1、psu.T.00020981.1、psu.T.00030776.1、psu.T.00030825.1和psu.T.00031480.1的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余均為穩(wěn)定蛋白.

表1 牡丹基因組中的KCS基因及其編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)

2.2 牡丹KCS基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以擬南芥基因組中的KCS基因為參照，利用Maximum likelihood(ML，最大似然法)構(gòu)建牡丹基因組中的KCS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹.由圖1可知，演化樹由6個演化分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)組成，其中只有演化分支Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ中含有牡丹KCS基因，演化分支Ⅳ和Ⅵ中無牡丹KCS基因.演化分支I中含有psu.T.00024222.1；演化分支Ⅱ中含有psu.T.00002829.1、psu.T.00009670.1、psu.T.00019588.1、psu.T.00020981.1、psu.T.00023496.1和psu.T.00028502.1；演化分支Ⅲ中含有psu.T.00021950.1；演化分支Ⅴ中含有psu.T.00030776.1、psu.T.00030825.1、psu.T.00031480.1、psu.T.00007518.1和psu.T.00007901.1.對演化樹進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，psu.T.00007901.1的進(jìn)化分支最長，表明該基因的進(jìn)化速率較高.

圖1 牡丹基因組中KCS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

注：以擬南芥基因組中的KCS基因為參照，運用ML法構(gòu)建的演化樹，Bootstrap=1 000.括號中的數(shù)字表示該演化分支中含有的牡丹KCS基因數(shù)目.

2.3 牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

牡丹基因組中的13個KCS基因均包含3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C結(jié)構(gòu)域和Type Ⅲ polyketide synthase-like結(jié)構(gòu)域，如圖2所示.Type Ⅲ polyketide synthase-like結(jié)構(gòu)域的大小為150～290個氨基酸，3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C結(jié)構(gòu)域的大小為80個氨基酸左右.

圖2 牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域及位置

KCS基因編碼蛋白質(zhì)序列的保守基序預(yù)測結(jié)果表明，如圖3所示，牡丹KCS基因編碼蛋白序列中的保守基序的種類和數(shù)量是不同的.KCS基因編碼蛋白質(zhì)基序較為相似的KCS基因組成同一或演化關(guān)系較近的演化分支，如圖1和圖3所示，不同演化分支或演化關(guān)系較近的演化分支中KCS基因的相似性較低.其中，牡丹KCS基因psu.T.00007901.1編碼蛋白質(zhì)的保守氨基酸基序數(shù)量最少為3個，與牡丹其他KCS基因成員差別較大，這一結(jié)果與系統(tǒng)演化關(guān)系分析結(jié)果相符.在13個牡丹KCS基因編碼蛋白質(zhì)中均含有motif 1，位于3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)]synthase Ⅲ C功能結(jié)構(gòu)域中.此外，該結(jié)構(gòu)域中還有motif 3和motif 10、motif 2、motif 4、motif 5、motif 6、motif 7、motif 8和motif 9分布在Type Ⅲ polyketide synthase-like功能結(jié)構(gòu)域中.

圖3 牡丹KCS 基因編碼蛋白質(zhì)保守基序圖

3 討論

KCS家族基因在調(diào)控超長鏈脂肪酸合成中起著關(guān)鍵的作用，在多種油料作物中已被發(fā)現(xiàn)和克隆.然而，關(guān)于牡丹基因組中KCS家族基因的存在情況還鮮有報道.本文通過同源比對鑒定牡丹基因組中的KCS基因，并通過生物信息學(xué)相關(guān)軟件對該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域和演化關(guān)系等進(jìn)行分析，這些初步分析的結(jié)果有助于該類基因編碼蛋白質(zhì)的功能研究.

牡丹基因組中共含有13個KCS基因，數(shù)目多于最基部植物無油樟(11個)和薔薇分支基部物種葡萄(8個)[6].雖然牡丹基因組中KCS基因的數(shù)目多于無油樟和葡萄，但相對于兩者的基因組大小(無油樟：748 Mb；葡萄490 Mb)，牡丹基因組(牡丹：13.8 Gb)中KCS基因的豐度較低.此外，植物基因組中的KCS基因數(shù)量與物種基因組大小無關(guān).例如：模式植物擬南芥的基因組大小為125 Mb，編碼21個KCS基因[17]，大豆的基因組大小為1 100 Mb，編碼27個KCS基因[6].十字花科植物蕪菁基因組中KCS基因的數(shù)目是目前已知最多的(31個)[6]，但其基因組大小僅為485 Mb.

KCS基因在植物中的起源極早，而且在植物的系統(tǒng)演化過程中逐步擴(kuò)張，從綠藻類植物中的單拷貝狀態(tài)通過基因復(fù)制擴(kuò)張成為被子植物中20～30個成員的基因家族[6].目前對KCS基因家族的研究主要集中在十字花科植物中，通過與擬南芥的21個KCS基因構(gòu)建演化關(guān)系樹，牡丹基因組中的13個KCS基因可組成4個演化分支(如圖1所示)，其中演化分支II中含有的KCS基因數(shù)目最多(6個).從結(jié)構(gòu)域和氨基酸基序保守性結(jié)果來看，同一演化分支中的KCS基因結(jié)構(gòu)較相似，推測其功能應(yīng)該較為類似.演化分支Ⅳ和Ⅵ中僅分別含有擬南芥的FAE1-LIKE亞類KCS基因和CER6亞類KCS基因，如圖1所示.2016年，Guo等人研究表明FAE1-LIKE亞類KCS基因是十字花科植物特有的[6]，而CER6亞類KCS基因可能在牡丹的演化歷程中發(fā)生了基因丟失.

作為新興的木本油料作物，牡丹種子不但含油量高，而且富含亞麻酸、亞油酸和油酸等超長鏈不飽和脂肪酸.研究牡丹KCS基因的演化特征可以進(jìn)一步發(fā)掘牡丹KCS基因的功能，加深對其脂肪酸合成機(jī)制的了解，為油用牡丹的分子遺傳育種提供一定的理論指導(dǎo).