羅利利 薛姑美 綦湘帆 杜旭泓 陳雅玲

(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330000)

中藥材蒲公英(TaraxacummongolicumHand.Mazz)是菊科蒲公英屬多年生草本植物，別名黃花地丁、婆婆丁、蒲公草、尿床草等，主要包括菊科植物蒲公英、堿地蒲公英及同屬植物的干燥全草[1]。蒲公英具有種質(zhì)資源豐富、種類繁多、分布范圍廣、適應(yīng)能力強(qiáng)、易于栽培等特點(diǎn)，是我國傳統(tǒng)的中藥材植物[2-4]。蒲公英含有黃酮類、酚酸類、多糖類、萜類、植物甾醇類、色素類、香豆素類以及微量元素等多種成分[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英中的黃酮以及酚酸類成分是蒲公英提取物中的主要抑菌成分[3,7-8]；蒲公英多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑制作用[9]；且其中的倍半萜類和香豆素類物質(zhì)也具有顯著的抑菌作用[10-13]。隨著人們對蒲公英抑菌作用研究的不斷深入，從蒲公英中分離提取出療效更好、毒副作用更低的生物活性成分，對于降低和控制某些細(xì)菌的耐藥性具有十分重要的意義。

目前，對蒲公英中化學(xué)成分分析主要集中于單一成分的含量及種類測定，而對其整體代謝成分及不同部位的成分差異研究還不夠深入。代謝組學(xué)主要是應(yīng)用高通量篩選技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法定量和定性分析生物體內(nèi)的內(nèi)源性代謝物[14]。代謝組學(xué)分析不僅能檢測到一些常規(guī)分析方法難以檢測到的物質(zhì)，而且能系統(tǒng)分析主要差異物對生物體生理生化功能的影響，已成為分析生物間生理差異的重要手段[15]?；诖x組學(xué)方法，可分析不同種類人參[16-17]以及不同段位鹿茸[18]中的代謝物成分差異。采用代謝組學(xué)可快速全面分析蒲公英不同部位多種具有生物活性代謝物的含量變化，有利于科學(xué)評估蒲公英不同部位藥用成分的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用打孔法測定蒲公英根、莖葉和花的水提取物以及醇提取物對變形桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜根考克氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的生長抑制作用，測定其最小抑菌濃度，獲得蒲公英不同部位的抑菌活性差異；基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)方法分析蒲公英不同部位的代謝物差異，探究蒲公英不同部位可能具有的抑菌成分以及特定藥用成分，旨在為利用蒲公英不同部位研制和開發(fā)抑菌效果更好的新藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、乙醇，均為色譜純，德國Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，美國BioBioPha/Sigma-Aldrich公司；乙醇(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；LB肉湯，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；蒲公英全株，產(chǎn)地江蘇徐州；變形桿菌(Proteushauser)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，江西省微生物菌種保藏管理中心保存菌株。

1.2 主要儀器

CBM 30A 超高效液相色譜，日本SHIMADZU公司；4500 QTRAP 串聯(lián)質(zhì)譜，美國SCIEX 公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，美國Waters公司；MM 400 研磨儀，浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠；RE-3000C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DNP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-3200 分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 UPLC-MS/MS分析 將蒲公英根、莖葉、花分別干燥，粉碎形成粉末后稱取100 mg，溶解于0.6 mL 70%甲醇提取液中，于4℃冰箱過夜，期間渦旋6次，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾上清液，保存于進(jìn)樣瓶，用于后續(xù) UPLC-MS/MS 分析。UPLC-MS/MS分析在邁維代謝公司(湖北武漢)進(jìn)行。

1.3.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相為A相(超純水-0.04%乙酸溶液)和B相(乙腈-0.04%乙酸溶液)。洗脫梯度：0 min 5%B；0～10.00 min 95%B，維持1 min；11.00～11.10 min，5%B，平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量4 μL。

1.3.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源溫度550℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿中，每個(gè)離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測[19]。

1.3.2 蒲公英不同部位初提取物的制備 根據(jù)孫長霞等[20]的方法，分別稱量蒲公英根、莖葉、花的粉末各100 g，用50%乙醇溶液加熱回流提取2次，離心過濾，合并提取液，濃縮至1 g·mL-1，得到醇初提取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將蒲公英根、莖葉和花的樣品粉末分別與超純水按1∶10(g∶mL)的比例混勻，浸泡1 h，文火加熱煎煮2 h，倒出藥液，12 000 r·min-1離心 10 min，真空抽濾后去掉濾渣，再將得到的藥液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 g·mL-1，得到水初提取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抑菌作用測定 參照譚才鄧等[21]的方法，30 mL的LB培養(yǎng)基中加入40 μL細(xì)菌的菌懸液，用L型涂布棒將菌懸液涂抹均勻。用已滅菌的打孔器在涂布了菌液的培養(yǎng)基上等距打5個(gè)孔，孔中分別注入35 μL 1 g·mL-1的蒲公英不同部位初提取物、無菌水和50%乙醇。28℃倒置培養(yǎng)24 h，取出平板，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以直徑表示抑菌圈的大小。

1.3.4 對細(xì)菌生長的抑制作用 參考綦國紅等[22]的方法，將變形桿菌菌液和不同濃度的蒲公英莖葉醇提取物按體積比9∶1的比例分裝于錐形瓶中，震蕩培養(yǎng)，每隔2小時(shí)用分光光度儀測定其在600 nm處的吸光度值(OD600)，重復(fù)3次，計(jì)算平均值，繪制生長曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 基于MVDB V2.0 數(shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性分析，代謝物定量利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。對定性和定量獲得的差異代謝物進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚類分析，根據(jù)偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)預(yù)測模型的穩(wěn)定可靠性。利用多維統(tǒng)計(jì)VIP(variable important in projection)值、單維統(tǒng)計(jì)P值及差異倍數(shù)(fold change, FC)篩選差異代謝物。差異倍數(shù)經(jīng)Log2轉(zhuǎn)化，選取VIP≥1，P<0.05，Log2 FC≥2或Log2 FC≤0.5的代謝物為差異代謝物，將得到的相應(yīng)差異代謝物提交到KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)網(wǎng)站進(jìn)行相關(guān)通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英不同部位初提取物抑菌活性

采用打孔法測定不同提取方法制備的蒲公英根、莖葉和花初提取物對變形桿菌、大腸桿菌、嗜根考克氏菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性(表1、圖1)。結(jié)果表明，蒲公英不同部位的水和醇提取物相比于50%乙醇對變形桿菌、嗜根考克氏菌和枯草芽孢桿菌有顯著的抑菌活性，其中對變性桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，而對大腸桿菌、銅綠假單胞菌無抑菌活性。由5種細(xì)菌的抑菌半徑可知，不同部位醇提取物中蒲公英花醇提取物抑菌活性最強(qiáng)，不同部位水提取物中花水提取物抑菌活性最強(qiáng)，根水提取物抑菌活性最弱。

表1 蒲公英不同部位提取物對5種細(xì)菌的抑菌半徑Table 1 Inhibitory radii of extracts from different parts of dandelion on five kinds of bacteria

注：A：大腸桿菌；B：銅綠假單胞菌；C：嗜根考克氏菌；D：枯草芽孢桿菌；E：變形桿菌。a：水；b：乙醇；c：莖葉；d：根；e：花。Note: A: Escherichia coli. B: Pseudomonas aeruginosa. C: Kocuria rhizophila. D: Bacillus subtilis. E: Proteus hauser. a: Water. b: Ethanol. c: Stem and leaf. d: Root. e: Flower.圖1 蒲公英不同部位醇提取物對5種細(xì)菌抑菌實(shí)驗(yàn)平板Fig.1 The inhibitory effects of alcohol extracts from different parts of dandelion on five kinds of bacteria

2.2 蒲公英最小抑菌濃度

根據(jù)蒲公英抑菌活性測定結(jié)果，選擇測定其莖葉醇提取物對變性桿菌的最小抑菌濃度。由圖2可知，不同濃度的蒲公英莖葉醇提取物對變形桿菌均有一定的抑制生長作用，0.125 g·mL-1提取物抑菌效果最弱，隨著濃度的逐步增大，對變形桿菌的抑菌效果逐步增強(qiáng)，當(dāng)濃度增至1 g·mL-1時(shí)，對變形桿菌直接有致死的作用。

圖2 蒲公英莖葉醇提取物對變性桿菌生長的影響Fig.2 Effect of alcohol extract from dandelion stem and leaf on the growth of Proteus hauser

2.3 蒲公英不同部位代謝物的分離與鑒定

基于UPLC-MS/MS檢測方法，從蒲公英不同部位的醇提取物中共檢測到449種代謝物(表2)，包括10種類型：黃酮類(107種)、脂類(69種)、酚酸類(60種)、其他類(51種)、氨基酸及其衍生物(47種)、核苷酸及其衍生物(35種)、有機(jī)酸類(34種)、生物堿類(27種)、木脂素和香豆素類(11種)、萜類(7種)以及鞣質(zhì)類(1種)，其中黃酮類化合物種類最多，其次是脂類、酚酸類。

分別對蒲公英根、莖葉和花代謝物含量排名前20的物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根中脂類占12種、酚酸類占3種、氨基酸及其衍生物和生物堿類各占2種、有機(jī)酸類占1種，其中相對含量最高的物質(zhì)是反油酸(5.95×107，脂類)、其次為異綠原酸B(5.78×107，酚酸類)；蒲公英莖葉中脂類占11種，氨基酸及其衍生物占2種，黃酮類占3種，酚酸類和生物堿類各占2種，其中含量最高的物質(zhì)是γ-亞麻酸(5.79×107，脂類)，其次為單酰甘油酯(?；?8∶3)異構(gòu)1(5.75×107，脂類)；蒲公英花中黃酮類占8種，脂類占5種，酚酸類占3種，生物堿類、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和有機(jī)酸類各占1種，其中含量最高的物質(zhì)是木犀草素(9.25×107，黃酮類)，其次是丙戊酸鈉(8.87×107，有機(jī)酸類)(表3)。

表2 蒲公英代謝物分類占比Table 2 The classified proportion of metabolites of dandelion

2.4 蒲公英不同部位差異代謝物分析

對蒲公英不同部位差異代謝物進(jìn)行主成分和OPLS-DA分析，通過T檢驗(yàn)，根相比于莖葉中篩選到顯著差異代謝物266個(gè)，其中上調(diào)代謝物64個(gè)，下調(diào)代謝物202個(gè)；根相比于花中篩選到顯著差異代謝物304個(gè)，其中上調(diào)代謝物66個(gè)，下調(diào)代謝物238個(gè)；莖葉相比于花中篩選到顯著差異代謝物246個(gè)，其中上調(diào)代謝物84個(gè)，下調(diào)代謝物162個(gè)。差異代謝物層次聚類分析發(fā)現(xiàn)黃酮類在蒲公英不同部位變化最大，花中大多數(shù)上調(diào)，而根中大部分下調(diào)；相反，脂類在根中大多數(shù)上調(diào)，在花中下調(diào)(圖3)。

對上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)分別排在前10位的代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蒲公英根相比于莖葉、花的差異代謝物上調(diào)幅度最大的物質(zhì)為木犀草素-7-O-葡萄糖苷，下調(diào)幅度最大的物質(zhì)分別為草酸和橙皮素C-丙二酰己糖苷。蒲公英根相比于花和莖葉大部分黃酮類和有機(jī)酸類均下調(diào)，大多數(shù)氨基酸及其衍生物和脂類上調(diào)(圖4)。此外，在蒲公英不同部位均檢測出特有代謝物，如橙皮素C-丙二酰己糖苷只存在根中；山奈酚3-O-β-(2″-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸、水楊酸芐酯、麥黃酮O-葡萄糖醛酸以及槲皮素7-O-丙二?；禾腔?己糖苷只在莖葉中發(fā)現(xiàn)；熊果酸、刺甘草查爾酮、木犀草素O-己糖基-O-戊糖苷、金圣草黃素5-O-己糖苷、D-丙氨酰-D-丙氨酸、3′, 4′, 7-三羥基黃酮和杠柳苷B這7種物質(zhì)只存在于花中(表4)。

表3 蒲公英根、莖葉和花代謝物中含量分別排名前20的物質(zhì)Table 3 The top 20 metabolites in roots, stems, leaves, and flowers of dandelion, respectively

2.5 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

生物體中復(fù)雜的代謝反應(yīng)一般由多個(gè)基因和蛋白質(zhì)互相影響和調(diào)控，最終導(dǎo)致代謝組發(fā)生系統(tǒng)性改變。利用差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集，其中富集因子為差異表達(dá)的代謝物中在對應(yīng)通路中的個(gè)數(shù)與該通路檢測注釋到的代謝物總數(shù)的比值，該值越大表示富集程度越大。代謝組數(shù)據(jù)結(jié)果表明，根相比于莖葉、根相比于花以及莖葉相比于花的差異代謝物中分別有194、195和197個(gè)代謝物被注釋到相應(yīng)代謝通路中

注：顏色從綠到紅表示代謝物的表達(dá)豐度從低到高。Note: Color from green to red indicates that the expression a bundance of metabolites is from low to high.圖3 蒲公英不同部位差異代謝物熱圖Fig.3 Heat map of different metabolites in different parts of dandelion

表4 蒲公英根、莖葉和花中特有的代謝物Table 4 Metabolites unique to the roots, stems, leaves, and flowers of dandelion

圖4 蒲公英根與莖葉、花上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)分別排在前10位的代謝物Fig.4 Metabolites with up-regulation and down-regulation of the top 10 differences in root vs stem and leaf and root vs flower, respectively

。篩選出的所有差異代謝物共富集在76條代謝通路上，前5條通路為代謝途徑、次生代謝物的生物合成、類黃酮生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成以及苯丙烷生物合成通路(圖5)。根相比于莖葉發(fā)生極顯著改變的代謝通路中排名第一和第二的分別是類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇生物合成，涉及木犀草素-7-O-葡萄糖苷、綠原酸、3, 4′, 7-三羥基黃烷酮、3-O-對香豆?？崴帷6-乙酰-L-賴氨酸、柚皮素、槲皮素、柚皮素查爾酮、芹菜素、三葉豆苷、3, 7-二-O-甲基槲皮素、芹菜素7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷和香葉木素-7-O-半乳糖苷差異代謝物；根相比于花中發(fā)生極顯著改變的代謝通路中排名前三的分別是次生代謝產(chǎn)物生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成以及類黃酮生物合成；莖葉相比于花中發(fā)生極顯著改變的代謝通路中排名第一和第二的分別是黃酮和黃酮醇生物合成以及類黃酮生物合成(圖5)。蒲公英不同部位的藥效不同可能與黃酮和黃酮醇生物合成以及類黃酮生物合成密切相關(guān)，這兩類物質(zhì)的合成途徑可為尋找和研發(fā)新的抗菌物質(zhì)提供參考。

3 討論

本研究結(jié)果表明，蒲公英50%醇提取物的抑菌活性優(yōu)于水提取物(表1)，與前人研究結(jié)果一致[20,23]。殼聚糖-蒲公英提取物、蒲公英多糖對大腸桿菌有一定的抑菌活性[24-25]。金三俊等[26]研究了5種中草藥對大腸桿菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黃芩和蒲公英組合對大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌效果。本研究中，蒲公英不同溶劑、不同部位提取物對大腸桿菌均未顯示抑菌活性(表1)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，可能與提取方法、濃度以及測定方法不同有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)中蒲公英花醇提取物的抑菌活性最強(qiáng)，根水提取物最弱(圖1)。前人研究表明，蒲公英根、莖、葉、花和全草的醇提取物中黃酮含量具有差異，花中含量最高，抑菌效果分析發(fā)現(xiàn)黃酮相較于蒲公英多糖及酚酸的抑菌效果最強(qiáng)[23, 27-29]。本研究代謝組分析發(fā)現(xiàn)，蒲公英根中相對含量最高的物質(zhì)是反油酸、脂類的相對含量較高；而花中相對含量最高的物質(zhì)是木犀草素(黃酮類)，黃酮類的相對含量較高(表3)，表明蒲公英花抑菌活性最強(qiáng)可能是其活性成分黃酮含量較高所致。

圖5 蒲公英根與莖葉、花差異代謝物通路分析圖Fig.5 Pathway analysis for differential metabolites in root vs stem and leaf and root vs flower, respectively

近年來關(guān)于蒲公英提取物抑菌作用的研究較多，但多數(shù)并沒有明確鑒定蒲公英提取物中何種成分有抑菌作用。蒲公英根、莖葉和花差異代謝物分析發(fā)現(xiàn)，根相比于莖葉、花，差異代謝物上調(diào)幅度最大的物質(zhì)為木犀草素-7-O-葡萄糖苷(圖4)。此外，花中含量最高的物質(zhì)是木犀草素。木犀草素是一種天然黃酮，在植物中通常以糖苷的形式存在，在不同生理系統(tǒng)中具有減輕氧化應(yīng)激和炎癥機(jī)制的作用。Son等[30]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素和木犀草素7-O-葡萄糖苷通過調(diào)節(jié)高同型半胱氨酸血癥ApoE基因敲除小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激來改善動脈粥樣硬化的形成。在角質(zhì)形成細(xì)胞中已經(jīng)證明，木犀草素-7-O-葡萄糖苷能夠通過激活酪氨酸激酶/轉(zhuǎn)錄因子3(JAK/STAT3)通路，從而抑制致炎基因的轉(zhuǎn)錄。Stefano等[31]研究表明，木犀草素-7-O-葡萄糖苷對該通路的抑制作用是通過損傷轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)的核轉(zhuǎn)位來實(shí)現(xiàn)的。此外，木犀草素-7-O-葡萄糖苷已經(jīng)被證明在生長的細(xì)胞中有較強(qiáng)的抗氧化作用，并且對細(xì)胞能量的產(chǎn)生也有重要的影響[32]。木犀草素-7-O-葡萄糖苷通過靶向JAK/STAT3通路抑制促炎細(xì)胞因子反應(yīng)，該抑制反應(yīng)能減少脂質(zhì)堆積和氧化，可能是心血管高?；颊邼撛诘闹委煵呗訹33]。由于蒲公英花中有較高含量的木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷，因此，蒲公英花可作為提取木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷的候選材料。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，打孔法和最小抑菌濃度測定揭示了不同提取方法和不同部位對蒲公英的抑菌活性均有影響，花提取物抑菌活性最強(qiáng)，根提取物最弱。基于UPLC-MS/MS的代謝組學(xué)技術(shù)研究蒲公英不同部位的代謝物差異具有可行性，結(jié)果顯示蒲公英根、莖葉和花中含量最高的物質(zhì)分別是反油酸(脂類)、γ-亞麻酸(脂類)及木犀草素(黃酮類)，根、莖葉和花中含量排名前20的物質(zhì)中黃酮類分別有0種、3種及8種。表明黃酮類物質(zhì)可能是蒲公英中主要抑菌活性物質(zhì)，且蒲公英花可作為提取木犀草素的原料。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，蒲公英不同部位的類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成具有差異，木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素7-O-葡萄糖苷、3, 4′, 7-三羥基黃烷酮和綠原酸等是關(guān)鍵代謝物質(zhì)。蒲公英不同部位可作為提取不同關(guān)鍵物質(zhì)的候選材料，其特有的代謝物也可為新型藥物研發(fā)提供新思路。