聶一帆，吳 靜，馬艷平，郝 樂(lè)，馮國(guó)清，劉振興，曹俊明

大口黑鱸腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白2基因克隆及免疫相關(guān)基因表達(dá)

聶一帆1,2，吳 靜2,4，馬艷平2，郝 樂(lè)2，馮國(guó)清2，劉振興2，曹俊明1,3

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 / 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；3. 廣東海洋大學(xué)，廣東 湛江 524088；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【】克隆大口黑鱸() 腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白2 (Tumor necrosis factor-alpha induced protein 2，TNFAIP2) 基因，命名為，探究在大口黑鱸免疫應(yīng)答中的作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中編碼序列（CDS）設(shè)計(jì)引物并克隆該基因；利用DNAMAN等軟件和SMART等預(yù)測(cè)并分析MsTNFAIP2氨基酸序列理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在魚(yú)諾卡氏菌() 和脂多糖刺激前后及、、和的mRNA表達(dá)變化。成功克隆CDS序列，長(zhǎng)度為1 932 bp，共編碼644個(gè)氨基酸，有一個(gè)Sec6超家族結(jié)構(gòu)域；與鱖 () TNFAIP2氨基酸序列同源性最高，為74.84%；魚(yú)諾卡氏菌和脂多糖刺激后，及、、和mRNA表達(dá)水平在頭腎、脾臟和淋巴細(xì)胞中顯著上調(diào) (< 0.05)。參與了大口黑鱸免疫應(yīng)答。

大口黑鱸；腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白2；基因克??；基因表達(dá)；脂多糖；魚(yú)諾卡氏菌

腫瘤壞死因子(Tumour-necrosis factor, TNF) 是主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)、先天和獲得性免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡和壞死等生理及病理過(guò)程[1-3]。由腫瘤壞死因子α (TNF-α) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白 (Tumor necrosis factor-alpha induced protein，TNFAIP) 是TNFAIP1 - TNFAIP9等，有物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、炎癥應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)節(jié)功能[4]。TNFAIP2亦稱B94或EXOC3L3，在內(nèi)皮細(xì)胞中由TNF-α誘導(dǎo)[5]，其基因主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞[6]、外周血單核細(xì)胞和成熟精子[7]，有激活Toll樣受體(TLR) 家族基因的特性[8]，也是一種蛋白酶激活受體(Protease activated receptors, PARS) 依賴蛋白，是激活PARS下游炎癥因子之一[9]。TNFAIP2通過(guò)核因子-κB (Nuclear factor kappa-B, NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信號(hào)通路[10]調(diào)控感染細(xì)菌后的炎癥反應(yīng)，可緩解細(xì)菌在宿主內(nèi)復(fù)制[11]。在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS) 刺激下，人體TNFAIP2可協(xié)同TNF-α、白介素1β (IL-1β) 和干擾素α2(IFN-α2) 等促炎性細(xì)胞因子抵抗病原入侵[11-12]。在硬骨魚(yú)中，僅見(jiàn)草魚(yú)()相關(guān)研究[10,13-15]，可作為miR-142a-3p的直接靶基因調(diào)控細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，未見(jiàn)其他硬骨魚(yú)類感染病原后TNFAIP2參與免疫調(diào)控的研究。

大口黑鱸() 又名加州鱸，是我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)種[16]，目前面臨魚(yú)諾卡氏菌() 的嚴(yán)重威脅[17]。本研究克隆大口黑鱸，分析該基因在大口黑鱸中的組織表達(dá)以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS) 與魚(yú)諾卡氏菌 (，N.S) 感染后、、、與的mRNA表達(dá)，為探討對(duì)大口黑鱸的免疫調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大口黑鱸幼魚(yú)[(22 ± 5) g]、成魚(yú)[(500 ± 50) g]分別購(gòu)自廣東省羅非魚(yú)良種場(chǎng)與廣州市五山菜市場(chǎng)，分別于30 cm×40 cm×40 cm玻璃缸、容積為160 L圓桶中暫養(yǎng)1周，溶氧>5.0 mg/L，水溫(26 ± 2)℃，每天8:00、18:00按魚(yú)體質(zhì)量2%～3%投喂商品料(福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司)，每天換水50%。高保真擴(kuò)增酶（MCLAB, I5HM-200）和pClone007 Versatile Simple Vector Kit購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒(R6934-02)購(gòu)自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑(R323-01) 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 試劑(Q712-02)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份技術(shù)有限公司，魚(yú)組織淋巴細(xì)胞分離試劑盒(LTS1080FZ) 購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，70μm細(xì)胞篩網(wǎng)(15-1070)購(gòu)自巴羅克集團(tuán)有限公司，LPS (BS007) 購(gòu)自biosharp公司，魚(yú)諾卡氏菌與大腸桿菌（DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)分離制備、保存。

1.2 鰤?mèng)~諾卡氏菌的制備

魚(yú)諾卡氏菌培養(yǎng)基配方：葡萄糖2 g，酵母粉1.5 g，磷酸氫二鉀0.075 g，氯化鈣0.02 g (單獨(dú)滅菌)，氯化鈉0.5 g，加去離子水100 mL，調(diào)pH至6.5 ± 0.2，121 ℃高壓滅菌20 min。按照體積比1∶100向新鮮培養(yǎng)基中加入魚(yú)諾卡氏菌菌種，于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱200 r/min培養(yǎng)4 d左右。

1.3 組織樣品采集與保存

取健康大口黑鱸幼魚(yú)3尾，實(shí)驗(yàn)前24 h停喂，用丁香酚麻醉，剖取脾、頭腎、皮膚、鰓、肝臟、肌肉、腦、腸于無(wú)菌無(wú)酶的凍存管，立即放入液氮，轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存，以檢測(cè)組織分布。

大口黑鱸幼魚(yú)隨機(jī)分為3組，每組40尾，分別腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、50 ng/μL LPS、1 × 108CFU/mL 魚(yú)諾卡氏菌各100 μL，在注射0、3、6、12、24、48、72 h時(shí)取脾和頭腎，每組每次取3尾，所有樣品均置無(wú)菌無(wú)酶凍存管，置液氮中速凍，于-80 ℃冰箱保存，以檢測(cè)基因表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞樣品的采集與保存

在無(wú)菌條件下分別取大口黑鱸成魚(yú)3尾，剖取頭腎，剪碎，研磨，組織勻漿液過(guò)70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)，離心，清洗，樣品稀釋液重懸后小心地沿管壁加在細(xì)胞分離液液面，于20 ℃、450條件下離心20 min，小心吸取中間的白環(huán)層，用清洗液清洗2次，以RPMI-1640 (含100 mL/L胎牛血清，1 000 U/mL青霉素和鏈霉素) 重懸細(xì)胞。吉姆薩、臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定（圖1），計(jì)數(shù)，將每尾分離到的淋巴細(xì)胞分成24組，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，鋪于96孔板中(5×105個(gè)/孔)，于25℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h。分別用LPS (50 ng/μL)、魚(yú)諾卡氏菌(1×108CFU/mL)和PBS刺激。分別于刺激后0、3、6、12、24、36、48、72 h收集細(xì)胞，于液氮中速凍，-80 ℃下保存，以魚(yú)組織淋巴細(xì)胞分離試劑盒分析細(xì)胞基因表達(dá)量。

圖1 大口黑鱸頭腎淋巴細(xì)胞

1.5 引物及序列驗(yàn)證

根據(jù)大口黑鱸脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：PRJNA806622)編碼序列(Coding sequence, CDS)，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。以大口黑鱸脾臟組織cDNA為模板，擴(kuò)增得目的片段，膠回收，與pClone007 Versatile Simple Vector Kit載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB (含100 μg/mL氨芐霉素) 固體平板，于37 ℃下倒置培養(yǎng)12 ～ 18 h，挑取10個(gè)單克隆菌株，于液體LB(含100 μg/mL氨芐霉素)培養(yǎng)基，以37℃、200r/min條件擴(kuò)大培養(yǎng)4 h，挑選陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。引物合成和序列測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.6 MsTNFAIP2 CDS序列分析

用clustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析及同源比對(duì)，用TMHMM (https://servi ces.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 分析有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，用ExPASy的ProtParam(https://web. expasy.org/protparam/)分析理化性質(zhì)，用MEGA X鄰接法 (bootstrap = 1 000) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，用SMART (http://smart.embl-heidel berg.de/) 分析基因結(jié)構(gòu)域，用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/ services/Si gnalP/)分析有無(wú)信號(hào)肽，用SOPMA (https://npsa-pra bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL (https:// swissmodel.expasy.org/) 預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 引物序列

1.7 RNA提取和cDNA合成

所有組織樣品總RNA均按照RNA提取試劑盒(OMEGA) 說(shuō)明書提取，使用NanoDROP LITE Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)測(cè)定RNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，將合格的RNA樣品參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃保存待用。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

用諾唯贊SYBR qPCR酶進(jìn)行qRT-PCR，所用引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L) 各0.4 μL，模板1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線采集以儀器默認(rèn)為準(zhǔn)。以[19]為內(nèi)參，所有樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，用2-△△CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[20]，用SPSS 23.0中單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，<0.05和<0.01分別代表差異顯著和差異極顯著，用Graphpad prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsTNFAIP2克隆結(jié)果和序列分析

全長(zhǎng)2 357 bp，克隆的CDS區(qū)域長(zhǎng)度為1 932 bp，共編碼644個(gè)氨基酸(圖2)，理論分子質(zhì)量約73.9 ku，等電點(diǎn)為5.58，說(shuō)明該蛋白為酸性蛋白，其中含量最多的是亮氨酸(12.7%)，谷氨酸(9.6%) 和賴氨酸(7.8%) 次之，含量最少的是半胱氨酸(1.1%) (表2)，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為100，帶正電荷的殘基總數(shù)為84，不穩(wěn)定指數(shù)為48.18，為不穩(wěn)定蛋白，該蛋白N端為蛋氨酸(甲硫氨酸)，其在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)狀細(xì)胞系中的半衰期為30 h，脂肪系數(shù)和總體親水性分別為89.75和-0.544，表明該蛋白為親水性蛋白(圖3)。

加粗ATG代表起始密碼子，加粗TGA代表終止密碼子，下劃線區(qū)域代表卷曲螺旋，陰影區(qū)域代表低復(fù)雜程度區(qū)

Bold ATG and TGA indicate translation initiation and termination codon; Underlined and shadow region represent coiled coil and low complexity area, respectively

圖2 大口黑鱸TNFAIP2及其推導(dǎo)的氨基酸序列

Fig.2 MsTNFAIP2and its deduced amino acid sequence

表2 MsTNFAIP2氨基酸數(shù)量組成

SignalP分析顯示，該蛋白無(wú)信號(hào)肽；TMHMM分析顯示，該蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)；SMART分析顯示，該蛋白存在一個(gè)卷曲螺旋(第92～120位氨基酸)、一個(gè)低復(fù)雜程度區(qū)(第288～304位氨基酸) (圖2)、一個(gè)Sec6超家族結(jié)構(gòu)域(第103～636位氨基酸) (圖4)。

圖3 MsTNFAIP2蛋白質(zhì)親/疏水性分析

2.2 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

MsTNFAIP2氨基酸序列同鱸形目魚(yú)類TNFAIP2同源較高(圖5)，為69.17%，與鱖 () TNFAIP2 (XP_044022203.1) 同源性最高，達(dá)74.84%，與鞍帶石斑魚(yú)(，XP_033497952.1)、尖吻鱸 (，XP_018559497.1)、奧利亞羅非魚(yú)(，XP_039459252.1)、花斑鰓棘鱸(，XP_042357203.1)、黃鰭棘鯛 (，XP_036928404.1)、大黃魚(yú)(，TMS20990.1)的同源性分別為69.89%、67.11%、66.96%、66.88%、64.81%、63.07%。

圖4 MsTNFAIP2 結(jié)構(gòu)域分析

黑色，深、淺灰色，白色部分相似性分別為100%、75%、50%、33%

進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(圖6) 顯示，大口黑鱸與鱖在同一小分支中，且所有魚(yú)類聚為同一大分支，與哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物分開(kāi)，證明魚(yú)類之間親緣關(guān)系最近，與哺乳動(dòng)物關(guān)系最遠(yuǎn)，表明MsTNFAIP2在魚(yú)類當(dāng)中穩(wěn)定遺傳且比較保守，符合物種進(jìn)化理論。

2.3 MsTNFAIP2二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)結(jié)果表明，大口黑鱸TNFAIP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋比例最高，為69.72%，無(wú)規(guī)則卷曲為27.02%，延伸鏈為1.55%，β-轉(zhuǎn)角為1.71% (圖7)；該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖8) 由α-螺旋配合多個(gè)β-轉(zhuǎn)角卷曲盤旋形成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果吻合。

2.4 MsTNFAIP2組織分布

組織表達(dá)結(jié)果表明(圖9)，在所有組織中均有表達(dá)，相對(duì)于腸道組織，脾臟表達(dá)量最高，其次是頭腎、皮膚、鰓、肝臟、肌肉、腦。

圖6 基于鄰接法的TNFAIP2氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

h, α-螺旋; c, 無(wú)規(guī)則卷曲; e, 延伸鏈; t, β-轉(zhuǎn)角

圖8 MsTNFAIP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖9 大口黑鱸MsTNFAIP2的組織表達(dá)

2.5 刺激后脾臟和頭腎中MsTNFAIP2、TNF-α、IL-1β、IL-10和IFN-γ的表達(dá)

頭腎和脾臟中及其相關(guān)的免疫基因、、和在LPS和魚(yú)諾卡氏菌刺激后均上調(diào)表達(dá)（圖10）。LPS刺激后，在脾臟中，、和均在48 h表達(dá)量平均值最大，分別為各自同時(shí)段PBS組的31.96、45.28、124.79、122.66倍(< 0.01)，表達(dá)量平均值在6 h最大，為6 h PBS組的32.33倍(< 0.01) ；在頭腎組織中，和在24 h表達(dá)量平均值最大，與同時(shí)段PBS組相比分別上調(diào)14.84、16.01、49.15倍(< 0.01)，和表達(dá)量平均值分別在3 h和12 h最大，分別為同時(shí)段PBS的466.57、221.36倍(< 0.01)。魚(yú)諾卡氏菌刺激后，在脾臟中，和表達(dá)量平均值均在24 h最大，分別為同時(shí)段PBS組的50.40、10.10、21.49倍(< 0.01)，則分別在48 h 和72 h表達(dá)量平均值最大，分別為同時(shí)段PBS組的17.33、63.98倍(< 0.01)；在頭腎中，和在24 h表達(dá)量平均值最大，分別為同時(shí)段PBS組18.26和61.00倍(< 0.01)，在刺激6 h時(shí)，和表達(dá)量平均值最大，分別為6 h PBS組的618.86、67.86倍(< 0.01)，在12 h表達(dá)量平均值最大，為同時(shí)段PBS組的16.48倍(< 0.01)。

*，與同時(shí)段PBS組相比，差異顯著（< 0.05）；**，與同時(shí)段PBS組相比，差異極顯著（< 0.01）

*, significant difference compared with time-matched PBS at level of< 0.05; **, significant difference compared with time-matched PBS at level of< 0.01

圖10 PBS、LPS和魚(yú)諾卡氏菌刺激后脾和頭腎中、、、和的表達(dá)變化

Fig. 10,,,andexpression in spleen and head kidney ofafter injecting PBS, LPS and

2.6 刺激后頭腎淋巴細(xì)胞中MsTNFAIP2、TNF-α、IL-1β、IL-10和IFN-γ的表達(dá)

圖11顯示，魚(yú)諾卡氏菌刺激淋巴細(xì)胞后和表達(dá)量平均值均在6 h最大，分別為6 h PBS組的9.7、8.82、7.56倍(0.01)，表達(dá)量平均值在3 h時(shí)最大，為3 h PBS組的4.33倍(0.01)，在72 h時(shí)表達(dá)量平均值最大，為72 h PBS組的39.17倍(0.01)。在LPS刺激后，表達(dá)量平均值在6 h最大，為6 h PBS組的3.39倍(0.01)，均在72 h表達(dá)量平均值最大，分別為72 h PBS組的3.79、7.10、95.87、14.14倍(0.01)。

*，與同時(shí)段PBS組相比，差異顯著（P < 0.05）；**，與同時(shí)段PBS組相比，差異極顯著（P < 0.01）

3 討論

在細(xì)胞凋亡分化及炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用[21]，主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)，可與EXOC1、EXOC2、EXOC4、EXOC7和EXOC8等25種蛋白發(fā)生交互作用[22]。但硬骨魚(yú)TNFAIP2研究仍處于起始階段。本研究從大口黑鱸脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到CDS全長(zhǎng)序列。MsTNFAIP2與鱖TNFAIP2氨基酸序列同源性最高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與鱖TNFAIP2聚為一支，與同源比對(duì)結(jié)果一致，與所有魚(yú)類均聚為同一大分支，表明TNFAIP2蛋白在魚(yú)類遺傳中較為保守。MsTNFAIP2在結(jié)構(gòu)上同哺乳動(dòng)物一樣，編碼一個(gè)Sec6結(jié)構(gòu)域，屬于Sec6超家族成員，與草魚(yú)TNFAIP2結(jié)構(gòu)一致[13]。

目前未見(jiàn)在硬骨魚(yú)中表達(dá)水平的相關(guān)研究本研究表明，在大口黑鱸頭腎、脾臟、鰓、肌肉、腸道、皮膚、肝臟和腦中均有表達(dá)，在脾臟中表達(dá)量最高，屬于組成型表達(dá)[23]。腹腔注射LPS和魚(yú)諾卡氏菌后，表達(dá)量在脾臟和頭腎中均顯著上調(diào)，但不同組織上調(diào)水平以及達(dá)到峰值時(shí)間點(diǎn)均不同，因此，在感染機(jī)體中又呈誘導(dǎo)型表達(dá)。

、和是典型的免疫反應(yīng)相關(guān)的急性炎性細(xì)胞因子[24-26]也是一種炎癥相關(guān)因子[21]。本研究表明，在LPS和魚(yú)諾卡氏菌刺激下的表達(dá)量變化與較為相似，表明受的調(diào)控[5]，證實(shí)MsTNFAIP2是由TNF-a誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]，還有研究表明TNFAIP2也可被[27][28]和LPS[6]等其他細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌。此外，本研究中、、和的表達(dá)趨勢(shì)與已報(bào)道的相關(guān)研究一致[29-32]。在感染早期(3 h)，脾臟作為硬骨魚(yú)免疫器官的主要靶器官，其免疫相關(guān)細(xì)胞因子在應(yīng)激反應(yīng)下共同發(fā)揮免疫應(yīng)答，導(dǎo)致mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。因此，本研究克隆的基因能協(xié)同其他細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)，在感染前后表達(dá)量變化可作為細(xì)菌感染的一個(gè)免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)。

頭腎是魚(yú)類最重要的免疫器官之一，含有淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞[33]等多種免疫細(xì)胞，是硬骨魚(yú)細(xì)胞因子合成和分泌的主要場(chǎng)所之一[34-35]。本研究表明，大口黑鱸分別用LPS和魚(yú)諾卡氏菌刺激3 h后，頭腎淋巴細(xì)胞中表達(dá)都表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，但魚(yú)諾卡氏菌刺激后，僅在感染初期(6 h) 極顯著上調(diào)，隨后降至正常水平，表明大口黑鱸同哺乳動(dòng)物一樣可參與急性炎癥反應(yīng)[36]；隨著感染時(shí)間增加(36 ～ 48 h)，淋巴細(xì)胞中上調(diào)的同時(shí)伴隨著、和的下調(diào)，表明抗炎癥因子對(duì)炎癥因子和有一定抑制作用；感染后期(36 ～ 72 h)，促炎因子一直處于極顯著上調(diào)表達(dá)的狀態(tài)，與軍曹魚(yú)()在感染美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種 (subsp.) 后變化趨勢(shì)相似[30]。文獻(xiàn)[30]認(rèn)為是美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種誘導(dǎo)感染后引發(fā)的一種免疫逃避機(jī)制，本研究和促炎因子在感染后期同時(shí)上升可能是魚(yú)諾卡氏菌誘導(dǎo)IL-10，而作為一種免疫逃逸方式。

綜上，本研究首次克隆CDS序列，在健康大口黑鱸不同組織中均有表達(dá)，脾臟表達(dá)量最高；在腹腔注射LPS和魚(yú)諾卡氏菌后，脾臟和頭腎中、、和mRNA表達(dá)顯著上調(diào)；大口黑鱸頭腎中分離的淋巴細(xì)胞在與LPS、魚(yú)諾卡氏菌共同孵育后，均能導(dǎo)致、、和顯著上調(diào)。這些結(jié)果揭示，魚(yú)諾卡氏菌感染誘導(dǎo)了大口黑鱸的炎癥反應(yīng)，其中、、、和均參與這一過(guò)程。該研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示TNFAIP2在魚(yú)類免疫應(yīng)答機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

[1] AGGARWAL B B. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword[J]. Nature Reviews Immunology, 2003, 3(9): 745-756.

[2] CABAL-HIERRO L, LAZO P S. Signal transduction by tumor necrosis factor receptors[J]. Cellular Signalling, 2012, 24(6): 1297-1305.

[3] DUBRAVEC D B, SPRIGGS D R, MANNICK J A, et al. Circulating human peripheral blood granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor alpha[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87(17): 6758-6761.

[4] 李濤, 李敏, 姬新穎, 等. 腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白家族與疾病的關(guān)系[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2014, 30(4): 433-436.

[5] CHEN L C, CHEN C C, LIANG Y, et al. A novel role for TNFAIP2: its correlation with invasion and metastasis in nasopharyngeal carcinoma[J]. Modern Pathology, 2011, 24(2): 175-184.

[6] SARMA V, WOLF F W, MARKS R M, et al. Cloning of a novel tumor necrosis factor-alpha-inducible primary response gene that is differentially expressed in development and capillary tube-like formation[J]. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950), 1992, 148(10): 3302-3312.

[7] WOLF F W, SARMA V, SELDIN M, et al. B94, a primary response gene inducible by tumor necrosis factor-alpha, is expressed in developing hematopoietic tissues and the sperm acrosome[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(5): 3633-3640.

[8] CHEVRIER N, MERTINS P, ARTYOMOV M N, et al. Systematic discovery of TLR signaling components delineates viral-sensing circuits[J]. Cell, 2011, 147(4): 853-867.

[9] SABAN R, D'ANDREA M R, ANDRADE-GORDON P, et al. Regulatory network of inflammation downstream of proteinase-activated receptors[J]. BMC Physiology, 2007, 7: 3.

[10] LI L Y, JIA X W, LIU Y, et al. lncRNA-SUMO3 and lncRNA-HDMO13 modulate the inflammatory response by binding miR-21 and miR-142a-3p in grass carp[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2021, 121: 104082.

[11] DU BOIS I, MARSICO A, BERTRAMS W, et al. Genome-wide chromatin profiling of-infected human macrophages reveals activation of the probacterial host factor TNFAIP2[J]. The Journal of Infectious Diseases, 2016, 214(3): 454-463.

[12] MOOKHERJEE N, BROWN K L, BOWDISH D M E, et al. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37[J]. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950), 2006, 176(4): 2455-2464.

[13] 白玉麟，徐曉雁，沈玉幫，等. 草魚(yú)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白2的克隆與表達(dá)分析[C] // 2018年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集. 出版地不詳: 出版者不詳, 2018: 156. https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CPFD&dbname=CPFDLAST2019&filename=OGSB201811001141

[14] TAO L Z, PANG Y F, WANG A Q, et al. Functional miR-142a-3p induces apoptosis and macrophage polarization by targeting tnfaip2 and glut3 in grass carp ()[J]. Frontiers in Immunology, 2021, 12: 633324.

[15] 陶麗竹. 草魚(yú)miR-21及miR-142a-3p在細(xì)菌感染過(guò)程中對(duì)炎癥因子調(diào)控的研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2020.

[16] CHEN Y J, LIU Y J, TIAN L X, et al. Effect of dietary vitamin E and selenium supplementation on growth, body composition, and antioxidant defense mechanism in juvenile largemouth bass () fed oxidized fish oil[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2013, 39(3): 593-604.

[17] HO P Y, CHEN Y C, MAEKAWA S, et al. Efficacy of recombinant protein vaccines for protection againstinfection in the largemouth bass[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 78: 35-41.

[18] ZHAO L L, LIANG J, CHEN F K, et al. High carbohydrate diet induced endoplasmicstress and oxidative stress, promoted inflammation and apoptosis, impaired intestinal barrier of juvenile largemouth bass ()[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2021, 119: 308-317.

[19] BYADGI O, CHEN C W, WANG P C, et al. De novo transcriptome analysis of differential functional gene expression in largemouth bass () after challenge with[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(8): 1315.

[20] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[21] JIA L, SHI Y D, WEN Y, et al. The roles of TNFAIP2in cancers and infectious diseases[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2018, 22(11): 5188-5195.

[22] XU Y, MA H X, YU H P, et al. The miR-184 binding-site rs8126 T>C polymorphism in TNFAIP2is associated with risk of gastric cancer[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e64973.

[23] 田佳音, 陳康勇, 張暢, 等. 斑馬魚(yú)腫瘤壞死因子(tnfα)及其受體(tnfrsf1a)應(yīng)答細(xì)菌和病毒感染的表達(dá)[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 29(2): 171-179.

[24] WATERS J P, POBER J S, BRADLEY J R. Tumour necrosis factor and cancer[J]. The Journal of Pathology, 2013, 230(3): 241-248.

[25] SACCHINI F, LUCIANI M, SALINI R, et al. Plasma levels of TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-10 during a course of experimental contagious bovine pleuropneumonia[J]. BMC Veterinary Research, 2012, 8: 44.

[26] FAWZY EL-SAYED K M, NGUYEN N, D?RFER C E. Ascorbic acid, inflammatory cytokines (IL-1/TNF-/IFN-), or their combination's effect on stemness, proliferation, and differentiation of gingival mesenchymal stem/progenitor cells[J]. Stem Cells International, 2020, 2020: 8897138.

[27] MCDERMOTT B T, PEFFERS M J, MCDONAGH B, et al. Translational regulation contributes to the secretory response of chondrocytic cells following exposure to interleukin-1β[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2019, 294(35): 13027-13039.

[28] HASE K, KIMURA S, TAKATSU H, et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex[J]. Nature Cell Biology, 2009, 11(12): 1427-1432.

[29] GRAYFER L, WALSH J G, BELOSEVIC M. Characterization and functional analysis of goldfish (L.) tumor necrosis factor-alpha[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2008, 32(5): 532-543.

[30] TRAN H B, CHEN S C, CHAUNG H C, et al. Molecular cloning of IL-6, IL-10, IL-11, IFN-? and modulation of pro- and anti-inflammatory cytokines in cobia () aftersubsp.infection[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2019, 230: 10-18.

[31] ZHOU Y J, PING O Y, TAO Y, et al. Comparison the function of Cyprinid herpesvirus 3 encoded two viral tumor necrosis factor receptors[J]. Aquaculture Reports, 2021, 21: 100878.

[32] ZHANG F, QIU X M, LIU Y, et al. Expression analysis of three immune genes interferon-gamma, Mx and interferon regulatory factor-1 of Japanese flounder ()[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2017, 60.DOI:10.1590/1678-4324-2017160243.

[33] HAO L X, SUN L. Comparative analysis of the expression patterns of eight suppressors of cytokine signaling in tongue sole,[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2016, 55: 595-601.

[34] STAFFORD J L, MCLAUCHLAN P E, SECOMBES C J, et al. Generation of primary monocyte-like cultures from rainbow trout head kidney leukocytes[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2001, 25(5/6): 447-459.

[35] HONG S, LI R G, XU Q Q, et al. Two types of TNF-α exist in teleost fish: phylogeny, expression, and bioactivity analysis of type-II TNF-α3 in rainbow trout[J]. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950), 2013, 191(12): 5959-5972.

[36] LI C, ZUO W W. IL-10could enhance IFNγ expression and suppress PD-1 expression in CD8 T cells from esophageal cancer patients[J]. Experimental Cell Research, 2019, 379(2): 159-165.

Molecular Cloning of Tumor Necrosis Factor-alpha Induced Protein 2 Gene and Expression Analysis of Immune-related Genes Associated with It in Largemouth Bass ()

NIE Yi-fan1,2, WU Jing2,4, MA Yan-ping2, HAO Le2, FENG Guo-qing2, LIU Zhen-xing2, CAO Jun-ming1,3

(1.,，510225,; 2.,,,510640,; 3.,524088,; 4.,,510642,)

【】To clone tumor necrosis factor-alpha induced protein 2 (TNFAIP2) gene of, named, and explore the role ofin the immune response of.【】Primer Premier 5 software was used to design the primers according to the sequence ofCDS from largemouth bass transcriptome. The physicochemical properties and structure of MsTNFAIP2 amino acid sequences were analyzed by DNAMAN and SMART online prediction websites. Expression of,,andmRNA were determined by Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) afterinfection and LPS stimulation.【】The CDS of, was successfully cloned and the length ofCDS was 1932 bp, encoding 644 amino acids with a Sec6 superfamily domain. MsTNFAIP2 shares an identity of 74.84 % with the TNFAIP2 of.andwere significantly up-regulated in the head kidney, spleen and lymphocytes afterinfection and LPS stimulation. 【】involves in the immune response of largemouth bass.

; tumor necrosis factor-alpha induced protein 2; gene cloning;gene expression; lipopolysaccharide;

聶一帆，吳靜，馬艷平，等. 大口黑鱸腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白2基因克隆及免疫相關(guān)基因表達(dá)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 42(3): 1-10.

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2022）03-0001-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.001

2021-12-14

廣東省自然科學(xué)基金(2022A1515012556, 2021A1515010498)；佛山市財(cái)政專項(xiàng)資金-2020年度共建廣東農(nóng)業(yè)科技示范市項(xiàng)目；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所創(chuàng)新基金（CX202113)；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XT202232）

聶一帆（1996―），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物病害。E-mail：yifann66@gmail.com

曹俊明（1962―），男，博士，教授，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)。E-mail：junmcao@163.com

劉振興（1981—），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物病害防控。E-mail：liuzhenxing@gdaas.cn

（責(zé)任編輯：劉慶穎）