趙 昊，史一然，章津嘉，陳蘭芬

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

生物體需要持續(xù)維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)才能完成正常的生命活動.Hippo信號通路最早在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化上保守，是在控制器官大小和維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的信號通路[1-3].哺乳動物中，Hippo信號通路的核心成員包括激酶Mst1/2(Ste20-like kinases 1/2,果蠅中Hippo的同源分子)、支架蛋白WW45(Salvador 同源物 SAV1)、激酶Lats1/2(large tumor suppressor 1/2)、支架蛋白MOB1(MOB kinase activator 1)和2個下游轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP(Yes-associated protein)和TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif).經(jīng)典的Hippo信號通路是通過活化Mst1/2-WW45復(fù)合物后，進(jìn)一步磷酸化和活化Lats1/2-MOB1A/B復(fù)合物，最終磷酸化YAP或TAZ，而磷酸化的YAP和TAZ會被降解或滯留在細(xì)胞漿中，無法進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEAD(transcriptional enhanced associate domain)結(jié)合，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄(圖1(a)).很多研究表明Hippo信號通路在組織穩(wěn)態(tài)、再生和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4-11]，如：在肝臟組織中，Hippo通路失活(敲除Mst1/2基因或過表達(dá)Yap基因)會導(dǎo)致肝臟增大和最終肝癌發(fā)生，而敲除Yap基因則會造成肝細(xì)胞死亡和肝臟衰竭.簡而言之，經(jīng)典Hippo信號通路主要通過抑制YAP的功能來調(diào)控細(xì)胞增殖和死亡，維持組織器官的穩(wěn)態(tài)平衡.最近，越來越多研究表明Hippo信號通路在維持免疫穩(wěn)態(tài)平衡中也發(fā)揮重要作用.

FAT4.非典型鈣黏蛋白4；GPCR.G蛋白偶聯(lián)受體；FGFR4.成纖維細(xì)胞生長因子受體4；TLR.Toll樣受體；TCR.T細(xì)胞受體；BCR.B細(xì)胞受體；CaMKⅡ.鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ；IRAK1/4.白介素1受體相關(guān)激酶1/4；NFκB.核因子κB；PKC.蛋白激酶C；RAP1.Ras相關(guān)蛋白1；RAPL.Rassf5b,Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族5b；LFA-1.淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1；DOCK8.胞質(zhì)分裂作用因子8；Rac1.Rac家族小三磷酸鳥苷酶(GTPase)1；Keap1.Kelch類ECH相關(guān)蛋白l；AKT.蛋白激酶B；Sirt1.Sirtuin1；Stat5.信號轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活蛋白5；ROS.活性氧；Nrf2.核紅細(xì)胞樣相關(guān)因子2；IRF3.干擾素調(diào)節(jié)因子3；Foxo1/3.叉頭框蛋白O1/3；Foxp3.叉頭框蛋白P3；RORγt.視黃酸相關(guān)孤兒受體γt.

1 Hippo信號通路與免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控

免疫系統(tǒng)是機(jī)體識別和清除異己的重要防御系統(tǒng)，對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要；在正常生理?xiàng)l件下，免疫系統(tǒng)本身的穩(wěn)態(tài)維持對于其發(fā)揮正常免疫應(yīng)答和免疫功能是必需的.免疫系統(tǒng)通過各種免疫細(xì)胞，包括天然免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞來持續(xù)性感受外環(huán)境，區(qū)分自己和異己，保護(hù)機(jī)體免受感染、自身免疫性疾病和腫瘤的侵?jǐn)_[12-13].在外來抗原或自身細(xì)胞發(fā)生突變等刺激下，機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，通過一系列合適的免疫反應(yīng)使得機(jī)體盡快恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡[13-14].當(dāng)免疫應(yīng)答過強(qiáng)或過弱時，都會造成機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生.免疫細(xì)胞可以通過相關(guān)受體感應(yīng)外界環(huán)境、啟動相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、產(chǎn)生下游效應(yīng)分子，以及通過可能的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來進(jìn)行免疫應(yīng)答和維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)平衡.探究機(jī)體在生理和病理?xiàng)l件下維持免疫穩(wěn)態(tài)平衡的分子機(jī)制，將有助于人們更好地理解自身免疫性疾病、感染、代謝失常和腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制，為防治這些疾病提供新的思路和分子靶標(biāo).

最近研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路在維持免疫穩(wěn)態(tài)平衡中也發(fā)揮重要作用，但與調(diào)控器官大小和組織穩(wěn)態(tài)的經(jīng)典Hippo信號通路不同，調(diào)控免疫系統(tǒng)功能的是以激酶Mst1/2為核心的非經(jīng)典Hippo信號通路(圖1(b))[15].早期研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路中Mst1-Nore1b(又稱RAPL或Rassf5b)復(fù)合物是TCR或趨化因子激活后，LFA-1介導(dǎo)的T細(xì)胞黏附和遷移運(yùn)動所必需的[16-17].激酶Mst1/2和其結(jié)合分子Nore1b以及底物MOB1在免疫組織和細(xì)胞中高表達(dá)[9].有意思的是，Mst1和Mst2雙基因敲除小鼠為胚胎致死表型，Mst1單基因敲除小鼠主要表現(xiàn)為免疫缺陷綜合征，而Mst2單基因敲除小鼠無明顯的免疫缺陷表型，表明Mst1在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著更為主導(dǎo)的功能，且Mst1和Mst2在功能上有一定互補(bǔ)性[9,18].臨床研究發(fā)現(xiàn)，激酶MST1功能缺失突變的病人表現(xiàn)為免疫缺陷綜合征，極易發(fā)生細(xì)菌、病毒和真菌感染,易得自身免疫性疾病等，且存在體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞減少、天然免疫細(xì)胞功能異常等臨床癥狀[19-20].在小鼠和病人中觀察到的表型和癥狀都暗示Hippo信號通路在天然免疫和獲得性免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而Mst1缺失導(dǎo)致的抗感染免疫缺陷，同時又有打破免疫耐受發(fā)生自身免疫性疾病的表型，也暗示Hippo信號通路在不同免疫細(xì)胞和不同免疫應(yīng)激條件下可能發(fā)揮截然不同的調(diào)控作用.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)中，激酶Mst1/2主要通過與其他一些調(diào)控免疫功能的信號通路互作來調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，包括整合素(integrin)信號[16-17,21-22]、TCR和BCR信號[18,23-25]、細(xì)胞因子受體信號[26-27]、TLR信號[28-32]、有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號[33-34]和抗病毒信號[35-37]通路等，統(tǒng)稱為非經(jīng)典Hippo信號通路.

本研究團(tuán)隊(duì)近年圍繞Hippo信號通路在免疫系統(tǒng)功能調(diào)控和穩(wěn)態(tài)維持方面取得了一些進(jìn)展.早期研究發(fā)現(xiàn)Mst1缺失會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在抗原或anti-CD3抗體刺激下，Mst1是調(diào)控T細(xì)胞增殖的內(nèi)在抑制分子，對于維持機(jī)體T細(xì)胞數(shù)目非常重要[18,25].最近研究還發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞中，Mst1/2和其下游的TAZ分子能夠抑制輔助性T細(xì)胞17(Th17)和增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的分化，因此在T細(xì)胞中，恰當(dāng)?shù)腍ippo信號通路調(diào)控對于防止自身免疫性疾病、維持免疫耐受至關(guān)重要[38].此外，在天然免疫細(xì)胞中，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)機(jī)械力受體Piezo1與TLR信號互作活化激酶Mst1/2，通過調(diào)控下游小G蛋白Rac1促進(jìn)ROS產(chǎn)生，調(diào)控吞噬細(xì)胞對于細(xì)菌的吞噬和殺傷作用[29-30]；同時激酶Mst1/2還可以感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，通過Mst1/2-Keap1-Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控細(xì)胞的抗氧化活性，從而維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[39].

2 Hippo信號通路在T細(xì)胞中的功能

骨髓中的淋巴樣祖細(xì)胞在遷移到胸腺后，經(jīng)過系列選擇過程，經(jīng)歷CD4-CD8-雙陰性(DN)胸腺細(xì)胞、CD4+CD8+雙陽性(DP)胸腺細(xì)胞、CD4+或CD8+單陽性(SP)胸腺細(xì)胞階段，最終發(fā)育為成熟T細(xì)胞.成熟T細(xì)胞隨后進(jìn)入血液循環(huán)，遷移到次級淋巴組織，接受抗原的刺激和活化.沒有接觸過抗原的T細(xì)胞稱為初始T細(xì)胞(na?ve T cell)，在淋巴管、外周血和組織液中反復(fù)循環(huán)遷移，這有助于其廣泛接觸到可能的抗原，該過程對于加強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)和維持長期的免疫記憶至關(guān)重要.大量研究表明Mst1在T細(xì)胞的遷移、歸巢、分化和活化中都發(fā)揮重要作用[16-18,21-22,25,27,38,40-42].

2.1 激酶Mst1/2調(diào)控T細(xì)胞的活化和遷移

在胸腺中，Mst1和Mst2蛋白在DP階段表達(dá)極低，而隨著發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐漸升高，最終在CD4+和CD8+的SP胸腺細(xì)胞中高表達(dá)；Mst1和Mst2的底物MOB1蛋白在DP和SP胸腺細(xì)胞中的表達(dá)量相當(dāng)，但是磷酸化的MOB1只在SP胸腺細(xì)胞中被檢測到，該結(jié)果表明Mst1和Mst2在早期胸腺細(xì)胞發(fā)育中(DP胸腺細(xì)胞階段之前)的作用不大[25].在外周血中，剛從胸腺中成熟遷出的初始T細(xì)胞高表達(dá)Mst1和Mst2；而與CD4+CD62Lhigh初始T細(xì)胞相比，在CD4+CD62Llow效應(yīng)/記憶T細(xì)胞中，Mst1和Mst2的蛋白和mRNA水平約下降90%[25].結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)在Mst1敲除小鼠中觀察到的T細(xì)胞高度活化和CD4+CD62Llow效應(yīng)/記憶T細(xì)胞比例增加的表型，可以推斷Mst1和Mst2蛋白水平的下降是初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?yīng)/記憶T細(xì)胞所必需的，T細(xì)胞中Mst1的活性水平?jīng)Q定了初始T細(xì)胞活化的閾值；與Mst1單基因敲除的表型不同，Mst2單基因敲除小鼠并不影響各組織中的T細(xì)胞數(shù)目；然而在Mst1敲除小鼠中，進(jìn)一步在造血細(xì)胞系中條件性敲除Mst2則會加重T細(xì)胞減少的表型，該結(jié)果表明激酶Mst2在Mst1敲除小鼠的淋巴組織中發(fā)揮代償性功能；其中，激酶Mst1活性對于T細(xì)胞數(shù)目和功能穩(wěn)態(tài)是必需的，因?yàn)橹挥幸吧蚆st1蛋白而非激酶缺陷型的Mst1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，才可以恢復(fù)Mst1缺失導(dǎo)致的T細(xì)胞缺陷表型[18].

與野生型小鼠相比，Mst1-/-Mst2fl/flVav-Cre小鼠(全身敲除Mst1，在造血系統(tǒng)中條件性敲除Mst2)的CD4+和CD8+SP胸腺細(xì)胞比例增多，這些SP胸腺細(xì)胞發(fā)生大量的凋亡事件，雖已成熟卻無法遷移出胸腺[18].Qa淋巴細(xì)胞抗原2(Qa-2)分子在胸腺細(xì)胞發(fā)育晚期高表達(dá)，在成熟胸腺細(xì)胞離開胸腺和成為外周成熟T細(xì)胞時表達(dá)量繼續(xù)升高；而CD24分子則相反，在胸腺細(xì)胞發(fā)育期高表達(dá)，而在成熟胸腺細(xì)胞離開胸腺時表達(dá)量下降，在外周成熟T細(xì)胞中不表達(dá)[43].因此Qa-2和CD24可以用來指示胸腺細(xì)胞和外周循環(huán)T細(xì)胞的表面標(biāo)記.Mst1-/-Mst2fl/flVav-Cre小鼠的CD4+和CD8+SP胸腺細(xì)胞主要表現(xiàn)為Qa-2highCD24low表型，同時高表達(dá)S1P(sphingosine 1-phosphate)受體(主要表達(dá)于胸腺細(xì)胞發(fā)育晚期)，說明這些細(xì)胞都是被滯留于胸腺中的成熟T細(xì)胞[18].這些Mst1/2缺失的SP胸腺細(xì)胞表面的趨化因子受體(如CCR7、CXCR3、CXCR4和CCR5)和整合素(CD11b和LFA-1)的表達(dá)水平與野生型細(xì)胞相當(dāng)，但如果將這些細(xì)胞放于外周循環(huán)中，同樣無法遷移進(jìn)入二級淋巴組織，表明Mst1/2缺失的胸腺細(xì)胞可以發(fā)育成熟為初始T細(xì)胞，但這些細(xì)胞無法遷出胸腺組織；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成熟的胸腺細(xì)胞中，趨化因子CCL19或S1P刺激下，Mst1/2通過磷酸化MOB1，促進(jìn)MOB1與DOCK8的相互作用，增強(qiáng)其鳥苷轉(zhuǎn)換因子(GEF)活性，促進(jìn)小G蛋白Rho家族成員(如Rac1)的活化，從而促進(jìn)胸腺細(xì)胞遷出胸腺[18].

在Mst1-/-Mst2fl/flVav-Cre小鼠和Mst1-/-Mst2fl/flLck-Cre小鼠(全身敲除Mst1，在胸腺發(fā)育期條件性敲除Mst2)都出現(xiàn)成熟胸腺細(xì)胞遷出胸腺缺陷、外周T細(xì)胞減少和高度活化的表型[18].為了進(jìn)一步研究Mst1/2在外周T細(xì)胞中的功能，構(gòu)建了僅在成熟和活化的T細(xì)胞中敲除Mst1和Mst2的Mst1fl/flMst2fl/flOx40-Cre小鼠，結(jié)果顯示這些小鼠的胸腺細(xì)胞發(fā)育正常，外周組織中T細(xì)胞數(shù)目也正常，但與野生型小鼠相比，在脾臟中效應(yīng)/記憶T細(xì)胞比例增加,說明Mst1/2缺失促進(jìn)了T細(xì)胞活化[38].在TCR刺激下，Mst1缺失的初始T細(xì)胞的增殖水平和細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、IL-4和干擾素γ(IFNγ)的表達(dá)水平都明顯比野生型細(xì)胞的高，但TCR下游的CD3、ZAP70(zeta chain of TCR associated protein kinase 70)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)和PLCγ1(phospholipase C-γ1)的磷酸化水平卻與野生型細(xì)胞的相當(dāng)[25].在敲除Mst1的T細(xì)胞中，Lats1/2的磷酸化水平?jīng)]有變化，而MOB1的磷酸化完全消失，該結(jié)果暗示了MOB1可能在T細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用[25]，而本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)敲除YAP并不能緩解Mst1缺失導(dǎo)致的缺陷表型，進(jìn)一步暗示Mst1在T細(xì)胞中不是以經(jīng)典Hippo信號通路來發(fā)揮作用的(未發(fā)表數(shù)據(jù)).在TCR刺激下，Mst1缺失的效應(yīng)/記憶CD4+T細(xì)胞的凋亡比例大幅增加，說明Mst1在這些T細(xì)胞中具有抗凋亡活性，Mst1缺失會增強(qiáng)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)效應(yīng)[25].總之，這些結(jié)果表明Mst1/2在維持T細(xì)胞數(shù)目、遷移和活化方面都發(fā)揮重要的調(diào)控作用.

2.2 Mst1/2-TAZ信號調(diào)控CD4+ T細(xì)胞的分化命運(yùn)

在TCR/抗原刺激活化和細(xì)胞因子等不同因素的調(diào)控下，初始CD4+T細(xì)胞會分化為不同亞型的T細(xì)胞，在免疫應(yīng)答和調(diào)控中發(fā)揮不同的作用[44].其中，接受TCR/抗原刺激的初始CD4+T細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)誘導(dǎo)下可分化為Treg，分泌TGF-β，發(fā)揮調(diào)控免疫耐受和免疫抑制的功能；而在TGF-β和IL-6的共同誘導(dǎo)下則分化為CD4+Th17，分泌IL-6和IL-17，參與防御胞外細(xì)菌和真菌感染、炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng).Treg和Th17比例的恒定對于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用，初始CD4+T細(xì)胞向Th17分化過多或向Treg分化過少，是導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的主要原因.Treg和Th17亞型的分化是交互調(diào)控的，其中TGF-β在調(diào)控CD4+初始T細(xì)胞分化為Treg和Th17中發(fā)揮重要作用，而在TGF-β培養(yǎng)條件下添加IL-6會抑制Treg的分化，促進(jìn)Th17的分化，這有助于機(jī)體在應(yīng)對感染等外界侵?jǐn)_時，促進(jìn)機(jī)體從免疫耐受到免疫炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)化[44].研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，6～8周Mst1-/-小鼠的胸腺和脾臟中CD4+Treg明顯減少，調(diào)節(jié)功能缺陷[41,45].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mst1通過多種方式調(diào)控和促進(jìn)Treg中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)和功能，包括直接磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Foxo1/3[41]、激酶AKT[41]和去乙?；窼irt1[45]或調(diào)控Rac1-DOCK8信號通路[27].

最近,本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)[38]：Mst1-/-小鼠的Th17分化比例顯著升高，小鼠易患干燥綜合征和大腸炎.用鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)抗原和弗氏完全佐劑(CFA)誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答，在Mst1fl/flMst2fl/flOx40-Cre小鼠的引流淋巴結(jié)中，Th17比例顯著高于野生型小鼠中，且Treg比例也明顯下調(diào).分析Hippo信號通路主要成員在幾種CD4+T細(xì)胞亞型中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)激酶Mst1/2下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ在Th17和Treg中表達(dá)水平都明顯高于初始CD4+T細(xì)胞中，且Th17的高表達(dá)更為顯著.臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病人的外周血記憶T細(xì)胞中TAZ的表達(dá)水平高于健康人中，且與Th17的核心轉(zhuǎn)錄因子RORγt水平呈正相關(guān).機(jī)制研究顯示，在TCR刺激初始CD4+T細(xì)胞時，TGF-β單獨(dú)刺激能夠大幅提升TAZ mRNA的表達(dá)水平；IL-6單獨(dú)刺激雖無法提高TAZ mRNA的表達(dá)水平，但能夠進(jìn)一步加強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)TAZ mRNA的表達(dá)，且TGF-β和IL-6通過其下游轉(zhuǎn)錄因子Smad3和Stat3來調(diào)控TAZ的轉(zhuǎn)錄表達(dá).

在調(diào)控Th17和Treg分化方面，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)TAZ能夠與Th17及Treg中的核心轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3形成復(fù)合物[38]：首先，作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，TAZ可以直接增強(qiáng)RORγt的轉(zhuǎn)錄活性；其次，由于Foxp3會被乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60(HIV-1 TAT-interactive protein,60 ku)乙?；种破浞核鼗偷鞍酌阁w降解[46]，TAZ通過與Tip60競爭性結(jié)合Foxp3，導(dǎo)致Foxp3乙酰化降低、泛素化增強(qiáng)和蛋白降解增加，從而削弱Treg的分化、促進(jìn)Th17的分化.因此，Mst1/2-TAZ信號在調(diào)控初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17和Treg的過程中起關(guān)鍵作用(圖2)，也證明了Hippo信號通路在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的重要性[38].

在Th17和Treg的分化過程中，TGF-β誘導(dǎo)TAZ的表達(dá)，而IL-6進(jìn)一步增加TAZ的表達(dá)水平；作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，TAZ會增強(qiáng)Th17中核心轉(zhuǎn)錄因子RORγt的轉(zhuǎn)錄活性以促進(jìn)Th17的發(fā)育分化；TAZ也可通過調(diào)控Treg核心轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的乙?；头核鼗剑龠M(jìn)Foxp3的降解，抑制Treg的分化.因此，Hippo信號通路可以調(diào)控機(jī)體免疫炎癥和免疫耐受的穩(wěn)態(tài)平衡.

3 Hippo信號通路在天然免疫細(xì)胞中的功能

天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體區(qū)分自我和非我，以應(yīng)對外環(huán)境侵?jǐn)_(如各種病原感染)并在第一時間作出免疫反應(yīng)和應(yīng)答的重要防線.單核巨噬細(xì)胞是最重要的引發(fā)炎癥反應(yīng)的天然免疫細(xì)胞，其與另一類重要天然免疫細(xì)胞中性粒細(xì)胞均屬吞噬型細(xì)胞，主要發(fā)揮吞噬和清除病原體的功能.當(dāng)病原體入侵機(jī)體時，天然免疫細(xì)胞通過模式識別受體，如TLR、C型凝集素樣受體、清道夫受體和補(bǔ)體受體等，來識別表達(dá)于病原體中的抗原相關(guān)的模式分子，如脂多糖(LPS)、脂蛋白、多肽和核酸分子等[47].

TLR可以識別多種不同的病原相關(guān)模式分子，在天然免疫細(xì)胞廣泛表達(dá)，是抵御病原入侵的第一道防線，也是連接天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁[12].本研究團(tuán)隊(duì)用各種TLR的配體刺激野生型小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)于細(xì)胞表面的TLR1、TLR2和TLR4在相應(yīng)配體或激動劑刺激活化后，都會導(dǎo)致Mst1/2底物MOB1的磷酸化水平明顯升高；表達(dá)于內(nèi)體上的TLR7、TLR8和TLR9在相應(yīng)配體或激動劑刺激后，MOB1的磷酸化水平?jīng)]有變化；而同樣表達(dá)于內(nèi)體上的TLR3在聚肌胞苷酸poly(I:C)刺激下，MOB1的磷酸化水平略有升高[30].利用敲除MyD88(myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88)的單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LPS(TLR4激動劑)、Pam3CSK4(TLR1和TLR2激動劑)和LTA(TLR2激動劑)激活Mst1/2依賴于MyD88信號，Mst1/2缺失并不影響TLRs介導(dǎo)的MAPK(包括p38、Jnk和Erk)的活化；然而與野生型BMDM相比，在Mst1/2缺失的BMDM中，LPS刺激導(dǎo)致更高的IKKα/β(IκB kinase α/β)和IκBα(inhibitor of NFκB kinase)磷酸化水平，以及相應(yīng)更高的IL-6和腫瘤壞死因子α(TNFα)表達(dá)水平[30].此外，Mst1可以通過磷酸化和降解IRAK1調(diào)節(jié)TLR信號通路，抑制慢性炎癥反應(yīng)和肝癌發(fā)展[31].同樣，結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)也可以通過TLR2-IRAK1/4信號通路來調(diào)控Mst1/2的活性，從而調(diào)控趨化因子CXCL1/2的表達(dá)和IRF3介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[48].而在果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)：Hippo信號是果蠅抵御革蘭氏陽性菌和真菌感染所必需的，果蠅脂肪體(果蠅的免疫器官)中Hippo信號缺失的免疫表型與Toll受體信號缺失的表型非常類似，說明在果蠅脂肪體中經(jīng)典Hippo信號通路在調(diào)控天然免疫功能中發(fā)揮重要作用；當(dāng)Hippo信號通路失活時，下游轉(zhuǎn)錄共激活因子Yorkie活化，可以直接促進(jìn)Cactus(果蠅中的NFκB抑制蛋白IκB)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而抑制Dorsal(果蠅中的NFκB)和Dorsal相關(guān)免疫分子(Dif)入核以及抗菌肽的表達(dá)[32].而在哺乳動物中，研究發(fā)現(xiàn)在LPS和IFNγ刺激下，YAP在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平升高促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化以及促炎癥因子IL-6的表達(dá)，而IL-4和IL-13刺激則抑制YAP的表達(dá)，因此巨噬細(xì)胞中特異性敲除YAP可明顯減輕葡聚糖硫酸鈉鹽誘導(dǎo)的腸炎發(fā)生[49].這些結(jié)果都表明Hippo信號通路在進(jìn)化上是保守的，但在高等哺乳動物中有著更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答.

3.1 激酶Mst1/2調(diào)控吞噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬和殺傷作用

Mst1功能缺失的病人易發(fā)生細(xì)菌、病毒和真菌的多發(fā)感染性疾病[19-20].本研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)Mst1-/-Mst2fl/flVav-Cre小鼠也經(jīng)常發(fā)生肺炎、肺膿腫等多發(fā)感染性.與Mst1-/-Mst2fl/flVav-Cre小鼠不同，Mst1fl/flMst2fl/flLyz2-Cre小鼠(在髓系細(xì)胞中條件性敲除Mst1和Mst2)在正常SPF(specific pathogen free)條件下飼養(yǎng)到7個月，均未發(fā)現(xiàn)有炎癥或感染癥狀；但在Mst1fl/flMst2fl/flLyz2-Cre小鼠中構(gòu)建盲腸穿刺誘導(dǎo)的細(xì)菌性腹膜炎(CLP)模型時，與野生型小鼠相比，模型小鼠的死亡率更高，各組織中的細(xì)菌載量更多，血清中的炎癥因子水平也更高[30].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TLR-MyD88信號介導(dǎo)的Mst1/2活化是吞噬型細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)吞噬和殺滅細(xì)菌所必需的[30]；在大腸桿菌(Escherichiacoli)或李斯特菌(Listeriamonocytogenes)感染時，Mst1/2缺失的BMDM或中性粒細(xì)胞中吞噬的細(xì)菌比野生型細(xì)胞中少，但在感染后期胞內(nèi)留存的細(xì)菌數(shù)卻明顯更多，這表明Mst1/2缺失影響了吞噬型細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬和殺傷作用.

ROS在吞噬細(xì)胞的細(xì)菌殺傷作用中扮演著重要的角色，這些ROS主要來源于吞噬體上還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的ROS和募集的線粒體產(chǎn)生的線粒體ROS(mROS).在Mst1/2缺失的吞噬細(xì)胞中，細(xì)菌感染后誘導(dǎo)產(chǎn)生吞噬體ROS和mROS的能力有明顯缺陷，是導(dǎo)致細(xì)菌殺傷能力下降的主要原因；此外，膜表面的TLR1、TLR2和TLR4活化后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量mROS和胞內(nèi)總ROS，而表達(dá)于內(nèi)體上的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9活化后則無法誘導(dǎo)相應(yīng)的ROS產(chǎn)生；有意思的是，用TLR1、TLR2和TLR4相應(yīng)的激動劑刺激Mst1/2缺失的BMDM或中性粒細(xì)胞，均無法誘導(dǎo)mROS和胞內(nèi)總ROS的產(chǎn)生，這與之前研究發(fā)現(xiàn)刺激這些膜上TLR才會激活Mst1/2的結(jié)果一致[30].在機(jī)制上，Mst1/2的磷酸化激活PKC，活化的PKC進(jìn)而磷酸化其底物二磷酸鳥苷(GDP)解聚抑制劑LyGDI，活化小G蛋白Rac1，促進(jìn)TRAF6-ECSIT(TNF receptor associated factror 6-evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathway,mitochondrial)復(fù)合物形成，最終促進(jìn)募集線粒體靠近吞噬體，并釋放mROS殺滅吞噬體中的細(xì)菌；而同時Rac1是NADPH氧化酶復(fù)合物的主要成員之一，因此活化的Rac1也會促進(jìn)吞噬體ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步增強(qiáng)吞噬體中ROS水平以殺滅細(xì)菌[30].該研究揭示了一條全新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即TLR-Mst1/2-PKC-Rac1-TRAF6-ECIST介導(dǎo)吞噬細(xì)胞中細(xì)菌誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的分子機(jī)制[30]，表明TLR下游信號并非只有激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，還可以通過蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用活化小G蛋白，影響細(xì)胞骨架快速調(diào)控細(xì)胞器(吞噬體和線粒體)的遷移，從而實(shí)現(xiàn)抗感染天然免疫應(yīng)答.

3.2 機(jī)械力受體Pizeo1調(diào)控Mst1/2促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗感染免疫

感染、炎癥和腫瘤發(fā)生會導(dǎo)致組織中細(xì)胞間質(zhì)的硬度、結(jié)構(gòu)和成分等物理微環(huán)境的改變，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境中這些物理和機(jī)械信號可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的分化、增殖和遷移[50].作為重要的天然免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞持續(xù)穿梭于體液和各組織中以應(yīng)對這些復(fù)雜的微環(huán)境，通過細(xì)胞本身硬度和彈性的內(nèi)在變化來感知物理微環(huán)境變化.已有研究發(fā)現(xiàn)，貼壁細(xì)胞的生長密度和培養(yǎng)基硬度可以調(diào)控Hippo信號通路活性，細(xì)胞生長密度較低時或細(xì)胞培養(yǎng)在硬度高的介質(zhì)上，都會抑制Hippo信號通路活性，導(dǎo)致下游分子YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞生長，因此YAP/TAZ是兩個極為關(guān)鍵的受機(jī)械力調(diào)控的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)分子，可以將物理信號最終轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)[51].

本研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)，TLR活化信號會激活下游的Mst1/2，且這一活化過程依賴于MyD88分子，但TLR-MyD88復(fù)合物如何激活Mst1/2并不明確[30].最近本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)在軟基質(zhì)上的巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌功能被嚴(yán)重削弱，外環(huán)境機(jī)械硬度信號是巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)菌吞噬和殺傷所必需的[29].機(jī)械敏感離子通道(MSC)中Piezo1離子通道是近年發(fā)現(xiàn)的在血管發(fā)育、紅細(xì)胞體積調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮重要作用的Ca2+通道[52].本研究團(tuán)隊(duì)的結(jié)果顯示[29]：Piezo1受體在多種髓系免疫細(xì)胞中高表達(dá)，在細(xì)菌感染或LPS等一些TLR配體刺激下，其表達(dá)量會進(jìn)一步升高.與野生型小鼠相比，天然免疫細(xì)胞中敲除Piezo1的Piezo1fl/flLyz2-Cre小鼠在CLP模型中生存率明顯降低，各組織中細(xì)菌載量顯著增加；而與Mst1/2缺失的BMDM表型類似，Piezo1缺失的BMDM的細(xì)菌吞噬和殺傷清除能力明顯低于野生型細(xì)胞.使用Yoda1(Piezo1激活劑)處理能夠顯著增強(qiáng)野生型BMDM的細(xì)菌吞噬和清除能力，而對Piezo1缺失的BMDM則沒有影響，說明活化Piezo1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗感染能力；細(xì)菌感染或LPS刺激會促進(jìn)TLR4和Piezo1發(fā)生組裝，從而增強(qiáng)依賴于Piezo1的鈣內(nèi)流和CaMKⅡ活化，CaMKⅡ再通過磷酸化Hippo信號通路的Mst1/2介導(dǎo)Rac1活化，促進(jìn)絲狀肌動蛋白重塑、增強(qiáng)吞噬作用、促進(jìn)線粒體和吞噬體ROS的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)殺菌能力.該結(jié)果表明機(jī)械力感受器Piezo1是激活Mst1/2-Rac1抗感染信號和誘導(dǎo)殺傷性ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵上游分子[29].近期也有研究發(fā)現(xiàn)Piezo1可以調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬清除衰老紅細(xì)胞和鐵代謝[53]，以及巨噬細(xì)胞通過Piezo1感受周期性的靜水壓變化[54]，從而將胞外信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號調(diào)控細(xì)胞的炎癥反應(yīng).這些研究揭示了機(jī)械力感知和應(yīng)答信號在巨噬細(xì)胞抗感染中的作用和機(jī)制，表明Piezo1所介導(dǎo)的機(jī)械力傳導(dǎo)信號對于宿主抗病原體的天然免疫應(yīng)答至關(guān)重要.

3.3 Mst1/2調(diào)控巨噬細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)

ROS在維持細(xì)胞正常的生理功能中發(fā)揮重要功能，是免疫吞噬細(xì)胞殺傷病原和激活炎癥反應(yīng)的主要武器，但過量的ROS也會對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷而導(dǎo)致衰老和死亡，因此調(diào)控ROS的產(chǎn)生和清除維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要.在體外研究中，常使用過氧化氫溶液來激活Mst1/2，表明ROS可以有效激活激酶Mst1/2[25].早期研究發(fā)現(xiàn)在線蟲(Caenorhabditiselegans)中敲除CST-1(Hippo激酶的同源分子)會加速衰老和縮短壽命[55].本研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)，Mst1/2是巨噬細(xì)胞在細(xì)菌感染時誘導(dǎo)產(chǎn)生大量殺傷性ROS所必需的，然而同時Mst1/2缺失的巨噬細(xì)胞中ROS本底水平明顯高于野生型細(xì)胞[30].在這些Mst1/2缺失的巨噬細(xì)胞中，蛋白的羰基化水平(氧化應(yīng)激標(biāo)記)、組蛋白H2A變體H2A.X的磷酸化水平(DNA損傷標(biāo)記)、PARPγ(poly ADP-ribose polymerase γ)和Caspase3切割分子的水平升高，同時細(xì)胞出現(xiàn)提早衰老的特征，而這些現(xiàn)象都可以在ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)的處理下得到緩解，表明Mst1/2在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)維持中也發(fā)揮重要作用[39].研究結(jié)果顯示[39]：Mst1/2缺失的巨噬細(xì)胞中抗氧化酶系統(tǒng)存在缺陷，在LPS、抗霉素(atimycin A)、魚藤酮(rotenon)、過氧化氫處理或大腸桿菌感染下，Mst1/2缺失的BMDM中抗氧化酶基因(如Nqo1、Ho-1、Gclc和Gclm等)的表達(dá)水平都明顯低于野生型BMDM中.這些抗氧化基因多由抗氧化效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控表達(dá)，而Nrf2在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)；與野生型細(xì)胞相比，Mst1/2缺失的巨噬細(xì)胞中Nrf2泛素化水平明顯升高，蛋白水平顯著降低.進(jìn)一步研究表明Mst1/2能夠感應(yīng)ROS，并被募集到吞噬體和線粒體的ROS產(chǎn)生部位而被釋放的ROS活化，進(jìn)而調(diào)控Nrf2來維持胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而在巨噬細(xì)胞對病原體清除期間保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，延緩衰老與死亡.

細(xì)胞中的Nrf2蛋白主要受泛素-蛋白酶體系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)控：在正常生理?xiàng)l件下，多聚化的Keap1與Cul3-E3 泛素連接酶靶向Nrf2，促進(jìn)Nrf2泛素化和蛋白酶體降解；而當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激條件下，Keap1發(fā)生解聚，Keap1-Cul3-E3 泛素連接酶無法穩(wěn)定結(jié)合到Nrf2上，導(dǎo)致Nrf2泛素化水平下降，蛋白水平升高，進(jìn)入細(xì)胞核中與ARE(antioxidant response element)序列結(jié)合以激活下游抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá)[56-57].在調(diào)控機(jī)制上，本研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)Mst1/2可直接結(jié)合Keap1，并對Keap1的4個位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，Mst1/2介導(dǎo)的Keap1磷酸化阻止了Keap1分子的多聚化，從而阻斷了Nrf2的泛素化和蛋白降解；進(jìn)一步利用病毒載體回補(bǔ)Nrf2，可明顯降低Mst1/2缺失的巨噬細(xì)胞中ROS水平、DNA損傷和細(xì)胞凋亡比例，證實(shí)在巨噬細(xì)胞中Nrf2是Hippo激酶下游的關(guān)鍵分子[39].上述研究揭示在巨噬細(xì)胞參與宿主防御過程中存在一條新的抗氧化和抗衰老信號通路，闡明了Mst1/2參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞維持氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)以實(shí)現(xiàn)清除病原體的同時，還能避免ROS誘導(dǎo)的自身損傷和細(xì)胞衰老的關(guān)鍵機(jī)制(圖3)，為進(jìn)一步研究氧化應(yīng)激如何促進(jìn)衰老相關(guān)炎癥和感染的發(fā)生和發(fā)展提供了重要的理論基礎(chǔ).

在細(xì)菌感染條件下，巨噬細(xì)胞中的TLR聯(lián)合機(jī)械敏感受體Piezo1激活Mst1/2，活化Rac1，促進(jìn)線粒體募集到吞噬體周圍產(chǎn)生殺傷性ROS，同時增強(qiáng)吞噬體細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶活性而產(chǎn)生更多殺傷性ROS，最終殺滅細(xì)菌；大量ROS會進(jìn)一步活化Mst1/2，通過磷酸化Keap1來調(diào)控Nrf2的穩(wěn)定性，促進(jìn)抗氧化基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng).因此，Hippo信號通路在調(diào)控巨噬細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用.

4 總結(jié)與展望

Hippo信號通路在進(jìn)化上高度保守，是調(diào)控細(xì)胞增殖和死亡、維持機(jī)體組織器官穩(wěn)態(tài)的重要通路，一直被認(rèn)為是重要的腫瘤抑制信號通路.近年來，本研究團(tuán)隊(duì)和其他課題組的工作揭示了Hippo信號通路在免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控中也發(fā)揮著重要功能.Mst1/2是Hippo信號通路的核心激酶，在巨噬細(xì)胞抗感染過程中，作為重要的分子開關(guān)協(xié)同調(diào)控兩種重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即誘導(dǎo)產(chǎn)生殺傷性ROS的信號和活化Nrf2以清除過量ROS的信號，以維持巨噬細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[29-30,39].這些結(jié)果揭示了天然免疫細(xì)胞在感染和不同外周環(huán)境刺激下，合適的免疫應(yīng)答需要胞內(nèi)多種細(xì)胞器和免疫效應(yīng)分子在時間和空間上的協(xié)同作用.一些環(huán)節(jié)的調(diào)控缺陷會影響吞噬細(xì)胞對病原體的吞噬和殺傷，無法維持胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞早衰和死亡.而在獲得性免疫調(diào)控方面，Hippo信號通路抑制促炎性Th17的分化，促進(jìn)免疫抑制性Treg的分化，在正常生理?xiàng)l件下對于維持免疫系統(tǒng)耐受和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，闡釋了當(dāng)Hippo信號通路失調(diào)時病人易發(fā)自身免疫性疾病的病理機(jī)制[38].這些研究表明非經(jīng)典Hippo信號通路成員可能是治療感染性疾病、自身免疫性疾病、免疫細(xì)胞衰老以及腫瘤等免疫失調(diào)疾病的潛在靶點(diǎn).

作為腫瘤抑制通路，靶向促進(jìn)Hippo通路活性治療腫瘤的策略不能忽略Hippo信號通路活化對于Treg分化和功能的促進(jìn)作用，因?yàn)門reg會抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的清除；然而這種靶向治療卻可能會通過抑制Th17的分化和增強(qiáng)Treg的抗炎癥效應(yīng)而有利于治療自身免疫性疾病.Hippo信號通路調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展以及組織再生和穩(wěn)態(tài)，同時也調(diào)控免疫應(yīng)答和功能，如果直接靶向Hippo通路的核心節(jié)點(diǎn)分子治療疾病，可能會帶來一些副作用，因此在設(shè)計小分子藥物時要考慮到作用位點(diǎn)、作用效率，以及作用是否可逆等因素，例如：本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的小分子藥物XMU-MP-1能夠可逆且特異性地抑制激酶Mst1/2的活性，因此可以通過精準(zhǔn)的用藥窗口促進(jìn)組織再生和修復(fù)而避免造成組織異常增生，已在肝臟和腸道損傷再生動物模型中取得了很好的治療效果[58].此外，只有深入研究Hippo信號通路在免疫系統(tǒng)中的精準(zhǔn)調(diào)控功能，特別是該通路如何協(xié)同調(diào)控其他經(jīng)典免疫信號通路，及其在調(diào)控腫瘤和免疫細(xì)胞互作中的作用，闡明在不同組織微環(huán)境和不同免疫應(yīng)答事件中的具體效應(yīng)分子，才能更好、更安全地將靶向Hippo信號通路作為治療腫瘤、損傷再生、感染和自身免疫病等相關(guān)疾病的治療策略.