劉雅靜，李冰玉，宋文沁，黎梅，劉戀

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060

糖尿病作為一種全身性系統(tǒng)性疾病，嚴重影響全身多個重要臟器的結(jié)構(gòu)和功能。高糖可顯著增加腦缺血再灌注損傷（CIRI）的發(fā)生率和致死、致殘率，而CIRI 又會產(chǎn)生應(yīng)激性高糖進而形成惡性循環(huán)［1］。研究表明，糖尿病是CIRI 早期神經(jīng)功能惡化的重要危險因素之一，持續(xù)高糖可加重血管內(nèi)皮細胞損傷，增加過氧化物與炎性因子的生成，降低氧自由基清除能力，最終導(dǎo)致梗死灶擴大，神經(jīng)功能受損［2-3］。自噬作為維護細胞網(wǎng)絡(luò)功能完整、能量代謝平衡的重要內(nèi)源性保護機制，可將受損的蛋白質(zhì)及細胞器降解成氨基酸等小分子物質(zhì)再次利用，以保障機體在特殊狀態(tài)下生理功能的正常運轉(zhuǎn)［4］。研究顯示，糖尿病可激活自噬，但在持續(xù)高糖刺激下自噬表達下降，細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，進而加重損傷［5］。新近研究證實，SIRT1-BMAL1 通路在晝夜節(jié)律、DNA 損傷修復(fù)、細胞存活等多項生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。BMAL1 可直接與自噬蛋白Atg14 啟動子中的E-box元件結(jié)合增加其表達，同時BMAL1基因敲除加劇了高糖誘導(dǎo)的自噬抑制，導(dǎo)致心肌細胞損傷加重［7-8］。褪黑素是一種內(nèi)源性合成、分泌的化合物，在大腦和腦脊液中濃度較高，其對包括能量代謝和體質(zhì)量調(diào)節(jié)在內(nèi)的眾多生理功能具有廣泛影響，并可激活包括SIRT1-BMAL1通路在內(nèi)的多種信號通路［9］。然而SIRT1-BMAL1 通路介導(dǎo)的自噬在糖尿病CIRI 中的作用尚未闡明，褪黑素是否通過該通路在糖尿病CIRI 中發(fā)揮作用尚不清楚。2019 年1 月—2020 年12月，我們通過觀察褪黑素糖尿病CIRI小鼠腦組織損傷的預(yù)防作用，探討其作用機制與SIRT1-BMAL1通路介導(dǎo)的自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件：濕度65% ± 5%，溫度（25±1）℃，12 h光照/12 h黑暗周期喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ）、TTC 溶液（Sigma，美國），褪黑素（Sigma-Aldrich，美國），SIRT1抑制劑EX527（Selleck，美國），SDS-PAGE 凝膠試劑盒（賽維爾，中國），BCA 蛋白測定試劑盒（愛必信，中國），LC3 抗體（Proteintech，美國），Beclin1 抗體、BMAL1 抗體（Abcam，美國），Atg14 抗體、SIRT1 抗體（CST，美國），乙酰化BMAL1（ac-BMAL1）抗體（Millipore，美國），β-actin、HRP標記的二抗（CST，美國）。

1.1.3 主要儀器 血糖儀（強生，美國），手術(shù)顯微鏡（鳳凰COX6100，中國），低溫高速離心機（Thermo，德國），電泳儀（Bio-Rad，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 糖尿病模型制備 所有小鼠連續(xù)5 d腹腔注射1%STZ 50 mg/kg，1周后尾靜脈檢測隨機血糖，以血糖≥16.7 mmol/L 并出現(xiàn)多飲、多尿、體質(zhì)量減輕癥狀為造模成功。造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)4 周，每周進行1次空腹血糖和體質(zhì)量測定。

1.3 腦缺血再灌注模型制備 采用大腦中動脈栓塞（MCAO）法。小鼠麻醉，暴露左頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），分別在CCA 近心端和ECA 遠心端結(jié)扎，在CCA 剪一小口將6-0 線栓由CCA 插到ICA，在稍遇阻力后停止，在CCA 切口上方用絲線將線栓活結(jié)固定。缺血1 h 后將線栓取出，隨即將CCA上的活結(jié)系緊，進行再灌注。

1.4 動物分組與處理 將24 只小鼠隨機分為糖尿病假手術(shù)組、糖尿病缺血再灌注組、糖尿病缺血再灌注+褪黑素組、糖尿病缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組，每組各6 只。假手術(shù)組分離大腦中動脈但不阻斷；缺血再灌注組采用MCAO 法建立腦缺血再灌注模型；缺血再灌注+褪黑素組采用MCAO 法建立腦缺血再灌注模型，于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg；缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑 制 劑組于MCAO 術(shù)前5、3、1 d 分別腹 腔 注射SIRT1 抑制劑5 mg/kg，采用MCAO 法建立腦缺血再灌注模型，于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg。于再灌注24 h后處死各組小鼠。

1.4 腦組織病理檢查 采用HE 染色法。取小鼠腦組織，石蠟包埋、切片，依次加入二甲苯、梯度乙醇水化，蒸餾水洗去乙醇，蘇木素染色。自來水沖洗，用含1%鹽酸的乙醇分色數(shù)秒；加入0.6%氨水處理，流水沖洗2 min。將切片置于伊紅染色液中染色2 min，用梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠片，光學(xué)顯微鏡下進行病理學(xué)分析。

1.5 腦梗死體積測定 采用TTC 染色法。取小鼠腦組織，-20 ℃速凍30 min后，沿冠狀位切成4～6張薄片，將切好的組織薄片依次放入TTC 溶液中，37 ℃避光染色30 min。待組織出現(xiàn)深紅色后，加入固定液固定24 h。取出組織薄片，用濾紙吸干固定液，拍照，圖像使用NIH Image J 軟件測定大腦皮層及梗死體積。整個梗死體積由大腦切片梗死體積相加獲得，最后結(jié)果以梗死體積占對側(cè)大腦皮層體積的百分比表示。

1.6 腦組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14和SIRT1-BMAL1 通路相關(guān)蛋白SIRT1、BAML1、ac-BMAL1 檢測 采用Western blotting 法。取100 mg缺血腦組織，BSA 法測定蛋白濃度，配置SDS-PAGE凝膠后電泳，待電泳結(jié)束后PVDF 轉(zhuǎn)膜，TBST 封閉2 h 后 分 別 加 入LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14、SIRT1、BAML1、ac-BMAL1 一抗（稀釋濃度均為1∶1000）4 ℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。使用醫(yī)用X射線膠片壓片后，依次放入顯影液顯影、定影液定影，晾干并掃描膠片，用BandScan 凝膠分析軟件分析膠片的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布檢驗采用Shapiro-Wilk 法，符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦組織病理檢查結(jié)果 假手術(shù)組神經(jīng)細胞胞膜完整，胞質(zhì)豐富，核圓形，結(jié)構(gòu)清晰；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組小鼠神經(jīng)細胞數(shù)量減少，胞體皺縮，胞質(zhì)疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失；與缺血再灌注組相比，缺血再灌注+褪黑素組上述改變減輕；與缺血再灌注+褪黑素組相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組上述改變加重。

2.2 各組小鼠腦梗體積比較 假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+褪黑素組、缺血再灌注+褪黑素+SIRT1 抑制劑組腦梗死體積分別為0、44.1% ±6.4%、16.2%±5.2%、29.3%±5.7%。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦梗死體積增加（P＜0.05）；與缺血再灌注組相比，缺血再灌注+褪黑素組腦梗死體積減少（P＜0.05）；與缺血再灌注+褪黑素組相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組腦梗死體積增加（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白表達情況 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦組織LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14表達降低（P均＜0.05）；與缺血再灌注組相比，缺血再灌注+褪黑素組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14表達增加（P均＜0.05）；與缺血再灌注+褪黑素組相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1 抑制劑組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14 表達降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

表1 各組小鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與缺血再灌注組比較，bP＜0.05；與缺血再灌注+褪黑素組比較，cP＜0.05。

組別假手術(shù)組缺血再灌注組缺血再灌注+褪黑素組缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組n 6 6 6 6 LC3Ⅱ/Ⅰ1.00±0.170.37±0.12a 0.77±0.14ab 0.47±0.13ac Beclin11.00±0.130.38±0.09a 0.83±0.12b 0.58±0.12abc Atg141.00±0.130.43±0.11a 0.90±0.13b 0.59±0.12ac

2.4 各組腦組織SIRT1-BMAL1 通路相關(guān)蛋白表達情況 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組SIRT1、BAML1表達降低，ac-BMAL1表達增加（P均＜0.05）；與缺血再灌注組相比，缺血再灌注+褪黑素組SIRT1和BAML1 表達增加，ac-BMAL1 表達降低（P均＜0.05）；與缺血再灌注+褪黑素組相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組SIRT1和BAML1表達降低，ac-BMAL1表達增加（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腦組織SIRT1-BAML1通路相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

表2 各組小鼠腦組織SIRT1-BAML1通路相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與缺血再灌注組比較，bP＜0.05；與缺血再灌注+褪黑素組比較，cP＜0.05。

組別假手術(shù)組缺血再灌注組缺血再灌注+褪黑素組缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制劑組n 6 6 6 6 SIRT11.00±0.110.35±0.13a 0.74± 0.17ab 0.41±0.14ac BAML11.00±0.160.43±0.13a 0.77±0.14b 0.51±0.12ac ac-BMAL11.00±0.181.86±0.25a 1.24±0.19b 1.61±0.22ac

3 討論

研究表明，糖尿病是缺血性腦卒中的獨立危險因素之一［10］，糖尿病患者較非糖尿病患者更易發(fā)生缺血性腦卒中。此外，糖尿病患者缺血性腦卒中的發(fā)病年齡也較非糖尿病患者顯著提前，并且糖尿病患者發(fā)生腦卒中后，其腦卒中的復(fù)發(fā)率、致殘率和病死率均顯著增加。即使是血糖控制良好的糖尿病患者，其心腦血管事件的發(fā)生率也未能顯著下降［11-12］。因此，如何減輕糖尿病CIRI具有重要的研究意義。

褪黑素是一種內(nèi)源性的吲哚胺分子，由松果體和各種其他組織如大腦、皮膚、腸道、視網(wǎng)膜、晶狀體和骨髓等合成。褪黑素的合成和分泌隨著年齡的增長而顯著減少，其相對缺乏可能與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如缺血性腦卒中的病理生理有關(guān)［13］。褪黑素可通過激活多種細胞內(nèi)信號通路，如SIRT1、SIRT3 等，對非糖尿病動物多臟器的缺血再灌注損傷具有保護作用。新近研究顯示，褪黑素在自噬調(diào)控和線粒體保護中亦發(fā)揮了重要作用［14-15］。自噬作為一種機體自我保護的內(nèi)源性機制，可被當(dāng)成一種細胞能量代謝的調(diào)控方式。在細胞營養(yǎng)不足時，為了維持基本生存需要，可通過自噬溶酶體降解一些相對次要的蛋白及一些相對多余的細胞器來供給物質(zhì)和能量，從而對細胞起到保護作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，高糖會破壞細胞自噬，從而引發(fā)神經(jīng)組織產(chǎn)生病理改變。通過恢復(fù)自噬，排除機體內(nèi)有害分子，可促進細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，減緩這一病理生理改變［17-18］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，自噬對糖尿病缺血再灌注損傷的保護作用顯著減弱或消失，但其相關(guān)病理機制研究甚少。

新近研究表明，SIRT1-BMAL1 通路在晝夜節(jié)律、DNA 損傷修復(fù)、細胞存活等多項生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SIRT1屬于Sirtuins家族成員之一，Sirtuins 是一群保守的Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易澹赏ㄟ^去乙?；{(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子、酶和蛋白質(zhì)，從而在轉(zhuǎn)錄、基因組穩(wěn)定性、代謝和壽命調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用［19］。SIRT1作為研究最為廣泛的Sirtuins家族成員，在大腦中的表達水平顯著高于其他器官，其可通過調(diào)節(jié)多種下游基因進而調(diào)控自噬、應(yīng)激、衰老等［20］。BMAL1 作為核心生物鐘蛋白，是中央生物鐘起搏器的重要組成部分，在腦中高度表達。除了調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律外BMAL1 還可作為轉(zhuǎn)錄因子激活許多基因的表達，并且在調(diào)控多種重要病理生理事件（包括葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和血栓形成）中發(fā)揮重要作用［21］。同時BMAL1 也被證明是自噬的正性調(diào)節(jié)劑，而自噬又與多種疾病的病理生理過程高度相關(guān)。BMAL1 的轉(zhuǎn)錄活性受翻譯后修飾（如泛素化、乙?；龋┑恼{(diào)控。有趣的是SIRT1 被證明在組蛋白去乙酰化和調(diào)控各種轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)揮重要作用，其可去乙?；⒓せ頑MAL1。此外，有報道發(fā)現(xiàn)BMAL1的乙?；蓪?dǎo)致其自身降解［22］。

本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組腦組織神經(jīng)元數(shù)量減少，胞體皺縮，胞質(zhì)疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失，腦梗死體積增大，SIRT1-BMAL1 通路相關(guān)蛋白表達降低，ac-BMAL1 表達升高，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1 和Atg14 表達降低，表明BMAL1 去乙?；浇档停允上嚓P(guān)蛋白表達被抑制；而缺血再灌注+褪黑素組腦組織損傷減輕，腦梗死體積減少，SIRT1-BMAL1 通路相關(guān)蛋白表達升高，ac-BMAL1表達降低，Atg14、Beclin-1 和LC3Ⅱ/Ⅰ表達升高，提示我們褪黑素可能是通過SIRT1-BMAL1 通路調(diào)控自噬進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用；而當(dāng)聯(lián)合使用SIRT1抑制劑EX527 阻斷SIRT1-BMAL1 通路后，褪黑素的神經(jīng)保護作用被削弱，證實褪黑素的保護作用是通過SIRT1-BMAL1通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，褪黑素可預(yù)防糖尿病CIRI 大鼠的腦損傷，保護腦神經(jīng)；其機制可能是通過激活SIRT1-BMAL1通路介導(dǎo)的自噬來發(fā)揮作用。