李明磊，孟令建，杜薇薇，王軍

徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002

早產(chǎn)兒腦損傷是早產(chǎn)兒生后常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴重時可遺留腦性癱瘓、視力損害、癲癇、智力和學習障礙等后遺癥，給醫(yī)療、社會和家庭帶來沉重的負擔。目前，早產(chǎn)兒腦損傷可供選擇的治療方法非常有限，成為困擾臨床醫(yī)生的難題之一。維生素D是體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的一類脂溶性維生素，人類大腦各個部位均存在維生素D 受體和維生素D 合成途徑的關(guān)鍵酶，是神經(jīng)組織發(fā)育和發(fā)揮功能的重要組成部分［1］。Th17/Treg 細胞水平失衡被認為是腦損傷后發(fā)生炎癥反應的一個重要原因［2］。研究顯示，維生素D可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞比例，降低腦損傷后的急性炎癥反應［3］。在實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）小鼠模型中，通過補充維生素D 可提高抗炎因子IL-10、IL-4、TGF-β 水平，減少促炎因子IL-17、IL-6、TNF-α 生成，糾正Th17/Treg 細胞失衡，抑制損傷后的神經(jīng)炎癥反應，從而降低EAE 的嚴重程度［4］。此外，維生素D 對多發(fā)性硬化癥、創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦卒中等多種神經(jīng)損傷后的炎癥反應也具有相似的調(diào)節(jié)作用［5-6］。本研究通過觀察腦損傷早產(chǎn)兒生后不同時間點血清25-（OH）D 的變化，探討其水平變化與炎癥反應的相關(guān)性，為臨床防治早產(chǎn)兒腦損傷提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019 年8 月—2021 年8 月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院出生、生后24 h內(nèi)入住NICU且存活的53 例早產(chǎn)兒，男29 例、女24 例。納入標準：①出生胎齡≤34 周；②具有腦損傷高危因素：腦缺氧缺血與血流動力學紊亂，如嚴重宮內(nèi)窘迫與出生時窒息、高或低碳酸血癥等；血液系統(tǒng)疾病，如凝血功能異常、貧血、紅細胞增多癥等；產(chǎn)科高危因素，如血栓或羊水栓塞、孕期并發(fā)癥及不良嗜好、異常分娩史等。③臨床資料完整。排除標準：由嚴重先天發(fā)育畸形、遺傳代謝紊亂、宮內(nèi)TORCH感染、生后嚴重感染性疾病、復雜型先天性心臟病、嚴重低血糖以及高膽紅素血癥等原因所引起的腦損傷。兩組早產(chǎn)兒均于出生后7 d開始口服維生素D 制劑800 IU/d，3個月后改為口服維生素D制劑400 IU/d，并建議服用至2歲［7］。于生后第1、3、7天各做1次顱腦超聲檢查，以后每周復查1次，于糾正胎齡36～40周完善頭顱MRI 檢查。顱腦超聲和（或）頭顱MRI 檢查出現(xiàn)各種類型顱內(nèi)出血（如腦室周圍—腦室內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下腔、小腦、腦實質(zhì)等部位出血）、腦室周圍白質(zhì)軟化、腦梗死等表現(xiàn)之一者即確診為腦損傷。根據(jù)影像學檢查結(jié)果，將早產(chǎn)兒分為觀察組24 例、對照組29 例。觀察組男15 例、女9 例，胎齡（31.6 ± 2.2）周，出生體質(zhì)量（1655.0 ± 500.0）g，1 min Apgar 評分5.0（3.3，6.8）分，5 min Apgar 評分（6.0 ± 1.8）分，孕母年齡（30.3±5.8）歲；對照組男14 例、女15例，胎齡（32.0 ± 2.1）周，出生體質(zhì)量（1704.1 ±414.8）g，1 min Apgar 評分6.0（4.0，6.0）分，5 min Apgar 評分（6.5 ± 1.6）分，孕母年齡（30.9 ± 7.4）歲。兩組患兒性別、胎齡、出生體質(zhì)量、1 min及5 min Apgar 評分、孕母年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），具有可比性。本研究獲得徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清25-（OH）D 及炎癥指標IL-17、IL-10 檢測 采集兩組出生后第1、7、14天橈動脈血1.5 mL，置于肝素抗凝管保存，30 min 內(nèi)檢測。4 ℃下3000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上層血清，采用ELISA 法檢測血清25-（OH）D、IL-17、IL-10 水平。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒均購自上海將來實業(yè)股份有限公司。血清25-（OH）D 水平＞20 ng/mL為正常，15～20 ng/mL為不足，＜15 ng/mL為缺乏［8］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。通過Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，各時間點血清25-（OH）D、IL-17、IL-10 水平比較采用重復測量方差分析。因本研究中各指標均不滿足球形度檢驗（P＜0.05），故關(guān)注多變量檢驗，因交互效應存在差異（P＜0.05），進一步行簡單效應分析，采用LSD 法進行兩兩比較。采用Pearson 相關(guān)分析血清25-（OH）D與IL-17、IL-10水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生后第1天血清25-（OH）D水平比較 對照組生后第1 天血清25-（OH）D 水平正常1 例，不足14例，缺乏14例；觀察組第1天25-（OH）D 水平缺乏24 例。觀察組血清25-（OH）D 缺乏患兒比例高于對照組（P＜0.05）。

2.2 兩組不同時間點血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比較 觀察組第1、7、14天血清25-（OH）D 水平均低于同期對照組，IL-17 水平均高于對照組，IL-10水平在第1、7 天低于對照組，第14 天高于對照組（P均＜0.05）。兩組血清25-（OH）D 水平在生后第7 天均較第1 天下降，第14 天水平逐漸上升，高于第1、7天（P均＜0.05）。觀察組血清IL-17 水平第7 天高于第1天，第14天較第7天降低（P均＜0.05）；血清IL-10水平第7天較第1天降低，第14天較第7天升高（P均＜0.05）。對照組血清IL-17 水平在第7、14 天均低于第1 天（P均＜0.05），第14 天與第7 天比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；血清IL-10水平在第7天低于第1天，第14天低于第7天（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時間點血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比較（±s）

表1 兩組不同時間點血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比較（±s）

注：與觀察組相同時間點比較，*P＜0.05，與同組第1 天比較，△P＜0.05；與同組第7天比較，▲P＜0.05。

組別觀察組第1天第7天第14天對照組第1天第7天第14天n 242925-（OH）D（ng/mL）12.23±2.0911.10±2.49△18.96±4.10△▲15.64±1.96*13.71±2.53*△21.99±2.99*△▲IL-17（pg/mL）25.99±3.6132.44±5.50△23.89±8.40▲20.14±2.49*17.20±3.44*△15.64±3.28*△IL-10（pg/mL）8.81±1.927.41±2.25△13.79±3.52△▲13.10±1.84*11.43±1.98*△9.30±3.22*△▲

2.3 觀察組不同時間點血清25-（OH）D 水平與IL-17、IL-10 水平的相關(guān)性 觀察組第1、7、14 天血清25-（OH）D 水平與IL-17 水平均呈負相關(guān)（r分別為-0.894、-0.585、-0.642，P均＜0.05）；第1、7 天血清25-（OH）D 水平與IL-10 水平呈正相關(guān)（r分別為0.655、0.599，P均＜0.05），第14 天與IL-10 水平無明顯相關(guān)性（P=0.266）。

3 討論

早產(chǎn)兒因其大腦發(fā)育不成熟，在缺氧窒息、感染等多重因素作用下，易發(fā)生各種出血性和（或）缺血性損傷。近年來，國內(nèi)外在早產(chǎn)兒腦損傷治療方面已進行了大量研究，如促紅細胞生成素、亞低溫治療、褪黑素、臍血干細胞、人羊膜干細胞等療法均取得一定進展，但在臨床上使用仍存在一定的爭議。在一項涉及345 例急性創(chuàng)傷性腦損傷患者的單中心研究中，輕中度腦損傷患者在損傷急性期維生素D水平顯著降低；肌注10 萬IU 維生素D 后，患者的行為和認知能力得到明顯改善［9］。研究表明，維生素D 主要通過影響神經(jīng)細胞分化、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子表達、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣信號傳導、抑制神經(jīng)炎癥反應、清除氧自由基以及促進神經(jīng)遞質(zhì)合成等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用［10］。維生素D在治療腦損傷方面展現(xiàn)出了一定的潛力，通過補充維生素D 治療和預防早產(chǎn)兒腦損傷已得到較多學者的關(guān)注。LOWE 等［11］報道，在50 例中重度新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）患兒中，超過70%存在維生素D不足，認為HIE可能增加25-（OH）D 的消耗，生后低水平的維生素D 可能是導致HIE 加重的影響因素。MCGINN 等［12］報道，低水平維生素D 與HIE 早期不良結(jié)局及腦損傷嚴重程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩組早產(chǎn)兒生后第1 天25-（OH）D 普遍較低，對照組第1 天25-（OH）D不足和缺乏各14例，而觀察組第1天25-（OH）D普遍缺乏。進一步分析顯示，觀察組血清25-（OH）D水平在生后各時間點均低于對照組；即使從生后第7 天開始補充800 IU/d 的維生素D3，至生后第14 天仍有部分早產(chǎn)兒不能達到正常水平。這可能與母親孕期維生素D貯備不足［13］以及腦損傷后消耗增多有關(guān)。在腦損傷小鼠模型中，損傷后的炎癥反應消耗了25-（OH）D，大約在第11天血清25-（OH）D水平降至最低點［14］。

神經(jīng)炎癥在繼發(fā)性損傷以及組織修復中發(fā)揮重要作用，Th17/Treg細胞比例失衡是腦損傷后炎癥反應發(fā)生的重要原因。IL-17 主要由Th17 細胞產(chǎn)生，病理情況下由外周進入中樞參與誘導神經(jīng)炎癥反應；IL-10 是Treg 細胞分泌的一種抗炎因子，對Th17細胞有負向調(diào)節(jié)作用。腦損傷發(fā)生后，損傷局部釋放損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs），如高遷移率組蛋白1、活性氧、過氧化物還原蛋白等，通過激活TLR2/TLR4 誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-23，進而增加IL-17 在小膠質(zhì)細胞和其他免疫細胞中的表達，而IL-17 主要通過NF-κB、MAPK/AP-1、C/EBP 等信號通路產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應［15］。IL-17 通過刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生趨化因子，招募中性粒細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活基質(zhì)金屬蛋白酶水解內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白破壞血腦屏障，DAMPs 通過破損的血腦屏障進入外周循環(huán)，激活多種細胞（包括中性粒細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞等）向腦實質(zhì)遷移和浸潤［16-17］，從而形成惡性循環(huán)。IL-17 還能增加凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax 表達，通過增加腦損傷后Bax/Bcl-2 比例，啟動神經(jīng)元凋亡程序［18］，進一步加重腦損傷。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清IL-17 水平在生后各時間點均高于對照組，IL- 10 水平在第1、7 天低于對照組；而第7 天補充維生素D后，第14天血清IL-10水平升高、IL-17水平下降。提示早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生早期存在明顯的炎癥反應，而25-（OH）D 可能通過調(diào)節(jié)損傷后血清IL-17/IL-10水平參與抗炎過程。

維生素D 可以阻斷NF-AT、Runx1、ERK/MAPK和PI3K/mTOR 相關(guān)信號通路，間接抑制IL-17生成，也可通過維生素D受體直接影響IL-17水平，并減少Th17 細胞上趨化因子受體的表達，來阻止其遷移至中樞；同時，維生素D 可減少促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、RANKL、COX-2 的生 成，通 過上 調(diào)Foxp3 促進Treg 細胞誘導生成IL-10，參與腦損傷后的抗炎過程［19］。IL-10 可直接抑制Th17 細胞產(chǎn)生IL-17，也能通過IL-10 受體的信號傳導增強Treg 細胞抑制IL-17生成的能力，而Treg細胞的抑制能力似乎也與血清25-（0H）D 水平相關(guān)［20］。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，觀察組各時點25-（OH）D 水平與IL-17 水平均呈負相關(guān)，第1、7 天血清25-（OH）D 水平與IL-10 水平呈正相關(guān)。以上進一步說明25-（OH）D 可能對IL-17/IL-10水平具有一定的調(diào)節(jié)作用，通過早期補充維生素D 抑制損傷后的炎癥反應可能是治療早產(chǎn)兒腦損傷的一個潛在途徑。

綜上所述，腦損傷早產(chǎn)兒生后各時間點血清25-（OH）D 水平均較低，且其水平變化與炎癥因子IL-17、IL-10 存在一定的相關(guān)性；25-（OH）D 可能通過影響IL-17/IL-10 水平抑制腦損傷后的炎癥反應?？紤]到維生素D 具有價格低廉、群眾接受性好等特點，并且在公共衛(wèi)生上也具有一定的意義，因此建議臨床醫(yī)生應加強對新生兒生后維生素D 水平的監(jiān)測，進一步展開維生素D 與早產(chǎn)兒腦損傷之間關(guān)系的相關(guān)研究。本研究的不足之處在于，首先未能收集母親孕期的營養(yǎng)狀況；其次研究樣本量??；因倫理限制無法設(shè)置維生素D 空白對照組，也沒有進行后續(xù)的隨訪；再次早產(chǎn)兒作為一個特殊群體，提供神經(jīng)保護所需維生素D 的劑量和水平尚不清楚，還需相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床試驗進一步研究。