柯冀 崔健 楊興國(guó) 杜鑫 馬波波 于磊

RNA修飾作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要組成部分[1]，其相關(guān)的生物學(xué)功能也越來(lái)越引起了人們廣泛的關(guān)注[2-4]。在這些修飾中，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A），即位于核糖核酸N6位點(diǎn)的腺苷甲基化，廣泛存在于mRNA和非編碼RNA中。m6A修飾通過(guò)的其“效應(yīng)器”發(fā)揮作用，包括甲基轉(zhuǎn)移酶（“寫(xiě)入器”）、去甲基化酶（“擦除器”）和m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合蛋白（“讀取器”）[5,6]，調(diào)節(jié)著RNA的穩(wěn)定性、剪接、翻譯以及出核，從而影響基因表達(dá)，在幾乎所有重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用[7-9]。研究[10-13]表明m6A效應(yīng)器在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、血管生成以及免疫逃逸。

肺腺癌長(zhǎng)期以來(lái)一直采用傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)治療[14]，隨著靶向治療和免疫治療的突破從根本上改變了肺腺癌的治療方式[15]，但只有小部分患者可以從免疫治療中獲益[16]。免疫治療是腫瘤免疫系統(tǒng)的重建，它依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間的相互作用，依賴(lài)于免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)程度[17]。某些m6A修飾在肺腺癌的進(jìn)展中起著重要作用，但關(guān)于m6A修飾對(duì)肺腺癌免疫微環(huán)境影響的研究較少。因此，綜合分析由多個(gè)m6A效應(yīng)器在腫瘤微環(huán)境中的對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，將有助于我們加深其對(duì)免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)肺腺癌患者更好地受益于免疫治療。在本研究中，我們選定了24個(gè)m6A效應(yīng)器，分析了m6A修飾與腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，構(gòu)建了三種具有不同免疫特征和臨床預(yù)后的m6A修飾模式，并發(fā)現(xiàn)LRPPRC有可能作為預(yù)測(cè)免疫治療效果的潛在生物標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（The Cancer Genome Atlas, TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）和加州大學(xué)圣克魯茲分校泛癌全基因數(shù)據(jù)分析工具數(shù)據(jù)庫(kù)（University of California Santa Cruz Xena, UCSC Xena）（https://xena.ucsc.edu/）下載肺腺癌隊(duì)列的基因突變數(shù)據(jù)、拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床資料。從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus, GEO）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載基因芯片數(shù)據(jù)集（GSE40419、GSE41271、GSE72094和GSE126044）。GSE40419數(shù)據(jù)集包含87個(gè)肺腺癌腫瘤組織和77個(gè)相鄰正常肺組織的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE41271和GSE72094數(shù)據(jù)集分別包含178個(gè)和381個(gè)肺腺癌腫瘤組織的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以及完整的臨床和生存信息。GSE126044數(shù)據(jù)集包含16個(gè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）腫瘤組織的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和抗PD-1免疫治療的應(yīng)答信息。將數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換及標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 m6A修飾基因突變、差異表達(dá)及生存分析 Maftools R軟件包用于分析TCGA肺腺癌隊(duì)列中24個(gè)m6A效應(yīng)器的基因突變。采用Studentt檢驗(yàn)比較TCGA肺腺癌隊(duì)列和GSE40419隊(duì)列中腫瘤組織和鄰近正常組織中24種m6A效應(yīng)器的差異表達(dá)。使用單變量Cox回歸分析在m6A效應(yīng)器和臨床表型之間進(jìn)行生存分析，然后進(jìn)行多變量Cox回歸分析，從而確定影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Spearman相關(guān)性分析用于評(píng)估不同m6A效應(yīng)器之間的相關(guān)性。

1.3 m6A修飾模式的聚類(lèi)、富集及免疫浸潤(rùn)分析 為了確定肺腺癌患者中由24個(gè)m6A效應(yīng)器調(diào)節(jié)的m6A修飾模式，使用Consensus Cluster Plus R軟件包進(jìn)行非監(jiān)督聚類(lèi)分析，評(píng)估TCGA肺腺癌隊(duì)列中m6A修飾特征。通過(guò)GSVA R包進(jìn)行基因集變異分析，使用 “C2Broadset”的KEGG基因集，闡明不同m6A聚類(lèi)之間的不同生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)CIBERSORT評(píng)估不同m6A修飾模式下的免疫細(xì)胞成分。根據(jù)Charoentong的研究[18]，使用GSVA R包中ssGSEA單樣本基因集富集分析的方法計(jì)算免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相對(duì)豐度。Estimate R軟件包用于計(jì)算肺腺癌患者的基質(zhì)和免疫評(píng)分。

1.4 免疫組織化學(xué)分析 肺腺癌樣本的組織芯片購(gòu)于SHANGHAI OUTDO BIOTECH （HLugA150CS03），參照此前的研究方法[19]進(jìn)行免疫組化分析。使用LRPPRC抗體（Abcam #ab97505）分析LRPPRC的蛋白表達(dá)水平。分別采用CD8（ZSGB-BIO #ZA-0508）和CD68（Abcam#125212）的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。免疫組化評(píng)分=染色面積（＜30%為1分，30%-60%為2分，＞60%為3分）×染色強(qiáng)度（無(wú)表達(dá)為0，弱陽(yáng)性為1分，中陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分）。根據(jù)免疫組化評(píng)分，分為低表達(dá)組（0分-3分）、中表達(dá)組（4分-5分）和高表達(dá)組（6分-9分）。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中m6A修飾的突變和表達(dá)差異 本研究共納入了24個(gè)m6A效應(yīng)器進(jìn)行分析，其中包括10個(gè)寫(xiě)入器，2個(gè)擦除器，12個(gè)讀取器（表1）。我們首先總結(jié)了m6A效應(yīng)器在基因組水平上的變異。567例肺腺癌樣本中有150例至少發(fā)生一個(gè)在m6A效應(yīng)器突變，頻率為26.46%，其中ZC3H13的突變頻率最高，頻率為4%，其次是KIAA1429和IGF2BP1（圖1A）。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，寫(xiě)入器METTL5和RBM15的突變分別與讀取器ELAVL1和IGF2BP1的突變顯著相關(guān)（P＜0.05）（圖1B）。拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）分析表明，CNV變異在m6A效應(yīng)器中普遍存在（圖1C），除了ELAVL1和YTHDC2，大多數(shù)讀取器的CNV是擴(kuò)增的（圖1C）。

表1 24個(gè)m6A效應(yīng)器列表Tab 1 Information of 24 m6A effectors

為了研究m6A效應(yīng)器在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，我們分別比較了TCGA肺腺癌隊(duì)列和GSE40419隊(duì)列中腫瘤組織與癌旁正常組織之間m6A效應(yīng)器的mRNA表達(dá)水平（圖2A和圖2B）。與正常組織相比，癌組織中共有6個(gè)讀取器（HNRNPA2B1、HNRNPC、IGF2BP1、LRPPRC、YTHDF1、YTHDF2）和3個(gè)寫(xiě)入器（KIAA1429、METTL5、RBM15）的表達(dá)明顯上調(diào)；相反，癌組織中唯一下調(diào)的是擦除器FTO（圖2C和圖2D），表明m6A修飾可能在肺腺癌中具有促癌作用。

2.2 m6A效應(yīng)器對(duì)肺腺癌預(yù)后的影響及相互作用 本研究通過(guò)單變量Cox回歸分析，分析了24個(gè)m6A效應(yīng)器的表達(dá)異常對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL5、HNRNPA2B1、HNRNPC和IGF2BP1的高表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05）?？紤]到臨床病理特征對(duì)患者生存率的影響，納入患者性別、年齡和腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期進(jìn)行多變量Cox回歸分析，結(jié)果顯示IGF2BP1和HNRNPC是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（圖3）。

m6A修飾是甲基化和去甲基化的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，受效應(yīng)器的表達(dá)和活性的影響。因此，我們?cè)趍6A效應(yīng)器之間進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同m6A效應(yīng)器之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)某些寫(xiě)入器和讀取器之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，如KIAA1429和YTHDF3、METTL14和YTHDC1、ZC3H13和YTHDC1、KIAA1429和LRRPRC（圖4A-圖4D）。部分寫(xiě)入器也表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)，如KIAA1429和CBLL1、METTL14和ZC3H13，這反映了它們的功能協(xié)同作用（圖4E、圖4F）。

2.3 m6A修飾模式及相關(guān)免疫特征 為了識(shí)別肺腺癌中不同的m6A修飾模式，我們根據(jù)24個(gè)m6A效應(yīng)器的表達(dá)水平進(jìn)行非監(jiān)督聚類(lèi)分析，從而確定三種不同的m6A修飾模式，稱(chēng)為m6A聚類(lèi)A、B、C。對(duì)三組m6A聚類(lèi)患者的預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)三組患者的總體存活率有顯著差異，其中m6A聚類(lèi)A的預(yù)后最好（圖5A）。GSVA富集分析結(jié)果表明，m6A聚類(lèi)A富集了較多與免疫激活相關(guān)的信號(hào)通路，如趨化因子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路等（圖5B）；而m6A聚類(lèi)B則與致癌信號(hào)通路的激活相關(guān)，包括DNA復(fù)制、細(xì)胞周期及三羧酸循環(huán)等（圖5C）。通過(guò)比較不同m6A聚類(lèi)之間的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)m6A聚類(lèi)A的基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分最高（圖5D）。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)豐度計(jì)算結(jié)果顯示，m6A聚類(lèi)A在腫瘤微環(huán)境中有更多的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，如活化B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓源抑制細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T1輔助細(xì)胞和T2輔助細(xì)胞（圖5E）。

2.4 m6A效應(yīng)器的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 由于m6A修飾模式影響了腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，我們通過(guò)Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步研究了24個(gè)m6A效應(yīng)器的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性（圖6A）。發(fā)現(xiàn)讀取器LRPPRC與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)對(duì)LRPPRC表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步的分組研究，結(jié)果表明，與LRPPRC低表達(dá)組相比，LRPPRC高表達(dá)組的基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分均較低（圖6B）。信號(hào)通路富集分析顯示，LRPPRC低表達(dá)組的免疫激活通路明顯富集（圖6C）。我們進(jìn)一步比較了28種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，發(fā)現(xiàn)其中24種在LRPPRC低表達(dá)組的腫瘤組織中浸潤(rùn)更多，特別是樹(shù)突細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞（圖6D）。同時(shí)，在LRPPRC低表達(dá)組的腫瘤細(xì)胞中樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)共刺激因子和黏附因子的表達(dá)也顯著上調(diào)（圖6E）。我們進(jìn)一步評(píng)估了LRPPRC對(duì)肺腺癌患者（GSE126044）抗程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）免疫治療應(yīng)答率的影響，發(fā)現(xiàn)在8例LRPPRC高表達(dá)患者中僅1例應(yīng)答，而在8例LRPPRC低表達(dá)患者中發(fā)現(xiàn)4例應(yīng)答（圖6F）。因此，我們推測(cè)LRPPRC的表達(dá)可能通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活，從而影響了免疫治療的應(yīng)答，是一種潛在的免疫治療標(biāo)記物。2.5 LRPPRC在組織標(biāo)本中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 采用免疫組化的方法，在68例肺腺癌組織中驗(yàn)證了LRPPRC的表達(dá)與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。結(jié)果表明，LRPPRC的表達(dá)與CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。在LRPPRC高表達(dá)患者中，腫瘤微環(huán)境中的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加（P＜0.001）；相反，LRPPRC高表達(dá)患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低（P＜0.001）（圖7）。驗(yàn)證結(jié)果與此前分析結(jié)論相一致。

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)對(duì)肺腺癌中m6A修飾突變率的研究，以及對(duì)比肺腺癌組織與正常組織中m6A效應(yīng)器在基因組和轉(zhuǎn)錄組層面的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了m6A效應(yīng)器可能對(duì)肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用。通過(guò)研究m6A效應(yīng)器對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)m6A效應(yīng)器對(duì)肺腺癌患者的預(yù)后有重要影響。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)m6A寫(xiě)入器、擦除器和讀取器之間的存在大量的相互作用，因此m6A效應(yīng)器的生物學(xué)功能可能是各效應(yīng)器的共同作用而實(shí)現(xiàn)的，即通過(guò)不同的m6A修飾模式而非單個(gè)基因改變。

近年來(lái)，已有研究[20]聚焦在不同腫瘤中m6A效應(yīng)器與免疫相關(guān)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了在很多腫瘤中m6A效應(yīng)器與免疫功能間也存在著一定的相互作用。在本研究中，我們不僅研究了某個(gè)特定m6A效應(yīng)器對(duì)肺腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，而且從宏觀層面全面分析了不同m6A修飾模式對(duì)肺腺癌免疫微環(huán)境的調(diào)控。我們基于24個(gè)m6A效應(yīng)器的非監(jiān)督聚類(lèi)分析構(gòu)建了三種不同的m6A修飾模式。其中m6A聚類(lèi)A的預(yù)后最好。在m6A聚類(lèi)A中，YTHDC2、METT14、ZC3H13、FTO和ALKBH5顯著高表達(dá)，這些基因都與各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。富集分析也提示m6A聚類(lèi)A富集了較多與免疫激活相關(guān)的信號(hào)通路。m6A聚類(lèi)A表現(xiàn)出大量的免疫浸潤(rùn)，從而有利于腫瘤對(duì)免疫治療應(yīng)答，這也提示預(yù)后較好的原因之一。與m6A聚類(lèi)A相比，m6A聚類(lèi)B中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，而DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路和其他腫瘤進(jìn)展相關(guān)通路明顯富集。同時(shí)，LRPPRC、IGF2BP1、METTL5和HNRNPC在m6A聚類(lèi)B中高表達(dá)。已有研究[16,21-24]表明，這些基因在各類(lèi)腫瘤中都廣泛參與了促使腫瘤進(jìn)展的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，并與導(dǎo)致生存期縮短相關(guān)。這可能也是m6A聚類(lèi)B臨床預(yù)后最差的原因之一?？傊?，在不同m6A聚類(lèi)之間，免疫微環(huán)境狀態(tài)不同且富集的相關(guān)通路不同，都表明不同的m6A修飾模式對(duì)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起著重要作用。

LRPPRC作為m6A的讀取效應(yīng)器，因其在肺腺癌中的顯著高表達(dá)且與大量免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，這引起我們的關(guān)注。越來(lái)越多的證據(jù)[25-27]表明，免疫治療的關(guān)鍵是有更多的免疫細(xì)胞浸入腫瘤。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)LRPPRC的高表達(dá)，減少了免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)，從而降低了對(duì)抗PD1免疫治療的敏感性。這也表明LRPPRC有可能作為抗PD1免疫治療效果的生物標(biāo)記物，并作為與免疫檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合的治療靶點(diǎn)。

總之，m6A修飾是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程，需要多個(gè)效應(yīng)器之間的共同作用。通過(guò)對(duì)m6A效應(yīng)器的綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)不同的m6A修飾模式在免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)中起著重要作用，加深了我們對(duì)m6A修飾在肺腺癌中的作用及其機(jī)制的理解。同時(shí)，LRPPRC有可能作為預(yù)測(cè)抗PD1免疫治療效果的潛在生物標(biāo)記物，有待今后更加深入的研究。

Author contributions

Ke J designed the study and wrote the manuscript draft.Cui J and Yang XG was responsible for data collection and statistical analysis.Du X and Ma BB performed experiments.Yu L supervised the research, provided suggestions for the implementation of the study and finalized the manuscript.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.