張 薇, 唐 彬, 趙 勇, 張志妮, 鄧新燕

(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州 510006)

目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施中無(wú)菌水的相關(guān)報(bào)告很少。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施的無(wú)菌水系統(tǒng)猶如人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，不僅供給動(dòng)物不可或缺的飲用水，也為屏障內(nèi)的日常清潔等工作提供用水，是影響動(dòng)物質(zhì)量和干擾實(shí)驗(yàn)研究的潛在因素。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與設(shè)施》GB 14925—2010 要求，清潔級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水應(yīng)達(dá)到無(wú)菌要求；而對(duì)于清潔級(jí)以上屏障設(shè)施中日常工作用水則沒(méi)有明確規(guī)定，但要求屏障環(huán)境中的沉降菌最大平均濃度［每0.5 h內(nèi)φ90 mm 平皿中菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）］≤3。屏障環(huán)境用水一旦污染也將導(dǎo)致動(dòng)物生存環(huán)境污染，因此，屏障設(shè)施內(nèi)的日常工作用水也應(yīng)達(dá)到無(wú)菌要求。有些屏障設(shè)施中無(wú)菌水系統(tǒng)制水不能持續(xù)保持無(wú)菌，遂采用高壓滅菌器滅菌制備動(dòng)物飲用水，而屏障設(shè)施內(nèi)日常工作用水則采用添加化學(xué)消毒劑的方法制備。但是能達(dá)到滅菌效果的化學(xué)消毒劑較少，且化學(xué)消毒或滅菌劑效果受影響的因素較多，如物體表面有機(jī)物、塵埃、水的酸堿性及水中有機(jī)物等均會(huì)降低滅菌效果。因此，屏障環(huán)境工作用水同樣需要控制微生物而達(dá)到無(wú)菌，才能消除屏障環(huán)境與動(dòng)物污染隱患。

中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心于2008年開(kāi)始將微電解無(wú)菌水系統(tǒng)應(yīng)用到屏障設(shè)施中供應(yīng)SPF 級(jí)動(dòng)物飲用水和日常工作用水，并于2018 年11 月新增微電解儀備用機(jī)。前期研究表明，微電解無(wú)菌水可以持續(xù)保持無(wú)菌，并對(duì)SD大鼠的血液生化等臨床指標(biāo)沒(méi)有影響［1］。2018年4月～2022年3月本中心對(duì)微電解無(wú)菌水系統(tǒng)的使用情況進(jìn)行了跟蹤觀察，然后對(duì)微電解無(wú)菌水系統(tǒng)配置、運(yùn)行管理中的細(xì)節(jié)加以總結(jié)和分析，以供同行借鑒。

1 材料與方法

1.1 微電解無(wú)菌水系統(tǒng)

微電解無(wú)菌水系統(tǒng)由超濾、微電解儀、循環(huán)輸水管路和屏障實(shí)設(shè)施內(nèi)終端供水口組成。微電解儀1 號(hào)和2 號(hào)互為備用，當(dāng)其中一臺(tái)發(fā)生故障時(shí)，啟用另外一臺(tái)。微電解用220 V 電源，實(shí)際工作電壓≤80 V，功率為280 W；微電解儀產(chǎn)生的電流為2 A～10 A。超濾材料主要有5 μm保安過(guò)濾膜、1 μm精密過(guò)濾膜、0.1 μm超濾膜。微電解無(wú)菌水系統(tǒng)由廣州惜水科技有限公司提供。系統(tǒng)工藝流程見(jiàn)圖1 所示，虛線(xiàn)左側(cè)為屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)管網(wǎng)布局，右側(cè)為屏障環(huán)境設(shè)施外管網(wǎng)及機(jī)房布局。

圖1 微電解無(wú)菌水系統(tǒng)的工藝流程簡(jiǎn)圖Figure 1 Process flow diagram of micro-electrolyzed sterile water system

1.2 主要試劑與儀器

SPX-600 智能生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海鴻都電子科技有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯無(wú)菌采樣瓶、大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；化學(xué)純36%～38%鹽酸購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠（批號(hào)：2021030216）。

1.3 水采樣點(diǎn)的設(shè)置及編號(hào)

設(shè)8個(gè)取水樣點(diǎn)。1、2號(hào)微電解儀的3個(gè)水龍頭是共同的終端出水實(shí)體。屏障設(shè)施內(nèi)3 個(gè)終端水龍頭對(duì)應(yīng)1號(hào)微電解儀的水樣標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)取樣點(diǎn)，對(duì)應(yīng)2 號(hào)微電解儀的水樣標(biāo)記為6 號(hào)、7 號(hào)、8 號(hào)；屏障設(shè)施外微電解機(jī)房的2 個(gè)取水點(diǎn)，即輸水管網(wǎng)回水取樣點(diǎn)（標(biāo)記為4 號(hào)）和微電解出水進(jìn)入輸水管網(wǎng)前取樣點(diǎn)（標(biāo)記為5號(hào)）各1個(gè)。

1.4 水樣采集

超濾水采樣：確認(rèn)微電解儀均處于關(guān)閉狀態(tài)，開(kāi)啟，1、2、3 號(hào)終端出水口放水5 min，然后用酒精燈燒灼出水口，用采樣瓶以無(wú)菌操作的方法對(duì)上述取水點(diǎn)進(jìn)行水樣采集，500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

微電解水采樣：開(kāi)啟微電解儀1 h后采樣。采樣點(diǎn)包括3 個(gè)終端出水口（1 號(hào)微電解儀啟用時(shí)命名為1、2、3 號(hào)水樣；2 號(hào)微電解儀啟用時(shí)命名為6、7、8 水樣）、1 個(gè)輸水管網(wǎng)回水取樣點(diǎn)4 號(hào)、1 個(gè)微電解出水口至輸水管網(wǎng)前的取樣點(diǎn)5 號(hào)。對(duì)采樣出水口放水5 min，用酒精燈燒灼出水口，以無(wú)菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

酸化水采樣：對(duì)終端出水口的水人工添加36%～38%化學(xué)純鹽酸，達(dá)到pH測(cè)試紙值2.5～3，以無(wú)菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

1.5 樣品接種培養(yǎng)

過(guò)濾法檢測(cè)：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020版中純化水、注射用水的檢測(cè)方法。于水平流潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作。每份樣品隨機(jī)取其中1 瓶500 mL 水樣，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌薄膜過(guò)濾器濾過(guò)后，取出濾膜，菌面向上貼于R2A 瓊脂培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)至少5 d，觀察菌落數(shù)。

國(guó)標(biāo)法檢測(cè)：依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14925—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》、GB 14926.41—2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法》檢測(cè)。另1瓶500 mL水樣按無(wú)菌操作分別吸取0.5 mL樣品，分別接種到腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白凍肉湯、血瓊脂平皿培養(yǎng)基中。其中，接種腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯培養(yǎng)基后，置于（36±1）℃培養(yǎng)至少14 d，并在第7和第14天時(shí)采用革蘭染色法鏡檢；接種血瓊脂平皿后，放置35～37 ℃培育箱中48～72 h，觀察血瓊脂平皿中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以及其菌落數(shù)；接種大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基后，置于25～28 ℃培養(yǎng)至少14 d，觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)。

1.6 結(jié)果判斷

光學(xué)顯微鏡下未觀察到細(xì)菌，同時(shí)R2A 瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂皿上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，大豆蛋白凍肉湯培養(yǎng)基中無(wú)真菌生長(zhǎng)，即判斷水質(zhì)合格，無(wú)菌水符合無(wú)菌要求，結(jié)果表示為陰性“－”。任何一個(gè)培養(yǎng)基中出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，即判斷為不符合無(wú)菌要求，結(jié)果表示為陽(yáng)性“＋”。

2 結(jié)果

2.1 超濾水與微電解水的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

關(guān)閉微電解儀時(shí)，經(jīng)過(guò)超濾處理的1、2、3 號(hào)水樣進(jìn)行微生物檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。開(kāi)啟2 號(hào)微電解儀1 h 后，4、5、6、7、8 號(hào)水樣進(jìn)行微生物檢測(cè)的結(jié)果均為陰性。兩種水樣采用過(guò)濾法的檢測(cè)結(jié)果與依據(jù)GB 14925—2010、GB 14926.41—2001國(guó)標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果一致，具體見(jiàn)表1。

表1 超濾水與微電解水的檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison between ultrafiltration water and micro electrolysis water

2.2 微電解儀故障與正常運(yùn)行期間的檢測(cè)結(jié)果

2018 年4 月～2022 年3 月跟蹤檢測(cè)期間，在編號(hào)為20180921 和20181011 的二次連續(xù)檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)1、2、3 號(hào)終端出水口水樣有細(xì)菌，對(duì)應(yīng)1 號(hào)微電解儀故障，此后增加備用微電解儀（命名為2 號(hào)微電解儀）；另外，在編號(hào)20210923 和20211215 的檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)6、7、8 終端水樣有細(xì)菌，對(duì)應(yīng)2 號(hào)微電解儀故障。結(jié)果提示，微電解儀正常運(yùn)行時(shí)，終端水樣檢測(cè)結(jié)果為陰性；若微電解儀出現(xiàn)故障，終端水樣檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（表2）。

表2 微電解儀故障時(shí)的水樣檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection result of water samples in case of failure of micro-electrolyzed sterile water system

2.3 微電解無(wú)菌水跟蹤監(jiān)測(cè)微生物結(jié)果

2018 年4 月～2022 年3 月共進(jìn)行17 次采樣檢測(cè)，除編號(hào)為20180921、20181011、20210923、20211215的終端水樣檢測(cè)有細(xì)菌（分別對(duì)應(yīng)1號(hào)和2號(hào)微電解儀故障）外，其他時(shí)間的跟蹤檢測(cè)結(jié)果顯示微電解無(wú)菌水系統(tǒng)的終端出水口1、2、3、6、7、8水樣、回水口4水樣、微電解出水口5水樣、酸化水樣經(jīng)培養(yǎng)14 d后均無(wú)細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)（表3），符合GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 2018年4月—2022年3月微電解無(wú)菌水微生物檢測(cè)情況Table 3 Microbial detection of micro-electrolyzed sterile water from April 2018 to March 2021

3 討論

本中心所用的微電解無(wú)菌水系統(tǒng)在跟蹤前期的檢測(cè)結(jié)果顯示，僅經(jīng)過(guò)超濾的水不能達(dá)到無(wú)菌，且在微電解儀故障時(shí)，所制終端水不能達(dá)到無(wú)菌；開(kāi)啟微電解儀并正常工作1 h后所制水能達(dá)到無(wú)菌。國(guó)內(nèi)有學(xué)者比較了反滲透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水與高壓滅菌水，發(fā)現(xiàn)前者不能達(dá)到無(wú)菌［2-3］。不能保持所制水無(wú)菌的原因可能與反滲透膜、前置超濾膜自身微生物滋生以及輸水管道內(nèi)、終端開(kāi)放口微生物滋生有關(guān)。同時(shí)，前期的檢測(cè)水樣采用過(guò)濾法與國(guó)標(biāo)法（水樣未經(jīng)過(guò)濾）的檢測(cè)結(jié)果一致，因此在后期的跟蹤監(jiān)測(cè)中采用了GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法。

屏障設(shè)施無(wú)菌水系統(tǒng)均由滅菌環(huán)節(jié)、輸水管路、供水終端組成。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用到屏障設(shè)施的無(wú)菌水系統(tǒng)主要有反滲透或+浸沒(méi)式紫外線(xiàn)、超濾（超濾+臭氧發(fā)生器+浸沒(méi)式紫外線(xiàn)）、在線(xiàn)滅菌。反滲透和超濾均是利用膜過(guò)濾法進(jìn)行凈化水。反滲透可以截留9×101道爾頓的小分子，能有效清除溶解于水中的無(wú)機(jī)物、有機(jī)物、細(xì)菌、熱源等。超濾可以截留相對(duì)分子質(zhì)量在1×103～1.5×105，不能過(guò)濾水溶性無(wú)機(jī)離子，也通常作為反滲透的前置過(guò)濾。但反滲透和超濾均需要防止過(guò)濾膜被細(xì)菌污染或堵塞，需定期監(jiān)控并更換過(guò)濾膜，否則導(dǎo)致過(guò)濾失敗，系統(tǒng)滋生細(xì)菌［4-5］。也有學(xué)者認(rèn)為，反滲透只可以去除大部分細(xì)菌，而不是全部［6］。同時(shí)這2 種系統(tǒng)的輸水管道以配置成循環(huán)管路為佳，而維持輸水管路內(nèi)的無(wú)菌則是防止污染的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。在線(xiàn)高溫滅菌是將水高溫滅菌結(jié)合降溫輸送，有文獻(xiàn)［2］報(bào)道其可以保持終端出水的無(wú)菌，但隨著在飲水瓶?jī)?chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，滋生細(xì)菌逐漸增多，同時(shí)能耗較高。微電解是通過(guò)改變電場(chǎng)強(qiáng)度，影響細(xì)菌的生理代謝而導(dǎo)致其死亡，同時(shí)水分子通過(guò)微電解發(fā)生強(qiáng)的氧化還原反應(yīng)，并釋放活性物質(zhì)［O］、HO2-、H2O2等自由基到循環(huán)水中發(fā)揮殺菌作用［1］。微電解的優(yōu)勢(shì)是保持循環(huán)輸水系統(tǒng)持續(xù)存在強(qiáng)氧化活性物質(zhì)而達(dá)到滅菌作用，尤其是可以持續(xù)保持輸水管路的無(wú)菌［1］；但將其灌裝飲水瓶后能維持多長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)菌，尚未做監(jiān)測(cè)。本研究通過(guò)對(duì)微電解無(wú)菌水系統(tǒng)多年的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，微電解無(wú)菌水系統(tǒng)的終端出水口水樣檢測(cè)無(wú)菌表明整個(gè)無(wú)菌水系統(tǒng)無(wú)菌；回水口水樣無(wú)菌表明輸水管路無(wú)污染；微電解出水口進(jìn)入供水網(wǎng)管前水樣無(wú)菌表明微電解儀器工作正常；而酸化水監(jiān)測(cè)結(jié)果保持陰性，是無(wú)菌水系統(tǒng)的第二屏障，可彌補(bǔ)無(wú)菌水不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)。

屏障設(shè)施無(wú)菌水系統(tǒng)的污染環(huán)節(jié)主要發(fā)生在滅菌主機(jī)功能減弱或故障、膜過(guò)濾或輸水循環(huán)管路污染、單行無(wú)循環(huán)管路或供水末端的逆行污染、動(dòng)物自動(dòng)飲水嘴的逆行污染。本中心在對(duì)微電解無(wú)菌水系統(tǒng)的跟蹤監(jiān)測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，取樣點(diǎn)的科學(xué)設(shè)置非常重要。因此在觀察中不僅設(shè)置了終端取水點(diǎn)，還設(shè)置了循環(huán)管路的回水取樣點(diǎn)和微電解儀出水口進(jìn)入管網(wǎng)前的取樣點(diǎn)，以此達(dá)到對(duì)無(wú)菌水系統(tǒng)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)點(diǎn)起到準(zhǔn)確監(jiān)控作用。一旦發(fā)現(xiàn)污染，可以通過(guò)污染取樣點(diǎn)位置判斷無(wú)菌水系統(tǒng)污染發(fā)生的具體環(huán)節(jié)，即準(zhǔn)確判斷是微電解儀器問(wèn)題、輸水管路問(wèn)題、終端水逆行污染還是取樣操作污染問(wèn)題。通過(guò)幾年跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)：微電解無(wú)菌水系統(tǒng)多以微電解儀發(fā)生故障導(dǎo)致殺菌失敗，在1號(hào)微電解儀工作時(shí)2次檢測(cè)陽(yáng)性，維修發(fā)現(xiàn)電解極片結(jié)垢板結(jié)，在兩極片中形成隔離層，使微電解減弱或不能正常工作。因此，微電解儀的維護(hù)非常重要。微電解無(wú)菌水系統(tǒng)維護(hù)的關(guān)鍵點(diǎn)是：定期清洗除垢，每月一次，每500 L 加檸檬酸500 g，開(kāi)啟微電解無(wú)菌水系統(tǒng)，使檸檬酸水在系統(tǒng)中循環(huán)保持1～2 h，減少礦物質(zhì)等雜質(zhì)在電極片上的結(jié)垢，保持陰極片、陽(yáng)極片正常發(fā)揮電解作用；過(guò)濾膜定期更換，保安過(guò)濾每3個(gè)月、精過(guò)濾膜6 個(gè)月、超濾膜12 個(gè)月更換一次。過(guò)濾膜的配置起到攔截微量懸浮物和微小雜質(zhì)顆粒以及部分微生物的作用，可實(shí)現(xiàn)水的預(yù)處理，減少電極片的結(jié)垢，但其不具備自?xún)艄δ?，不能持續(xù)保持無(wú)菌。經(jīng)2015—2017年［1］及近4年來(lái)的跟蹤監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在微電解系統(tǒng)正常工作時(shí)，微電解儀出水口、輸水管路、終端出水均沒(méi)有污染，后期還設(shè)置了備用微電解儀器，交替使用，以確保生產(chǎn)屏障設(shè)施中動(dòng)物飲用水和日常工作清潔用水的無(wú)菌。如沒(méi)有備用微電解儀且僅有的一臺(tái)微電解儀故障時(shí)，應(yīng)用高壓滅菌水替代，以保障屏障設(shè)施內(nèi)動(dòng)物飲用水和日常工作用水符合無(wú)菌要求。

屏障設(shè)施中動(dòng)物飲用水和日常用水一旦污染將直接導(dǎo)致動(dòng)物和環(huán)境的污染，因此，維持并保持屏障設(shè)施無(wú)菌水系統(tǒng)的無(wú)菌顯得極其重要。經(jīng)過(guò)多年跟蹤監(jiān)測(cè)的結(jié)果表明，微電解無(wú)菌水在屏障設(shè)施中應(yīng)用是可行的，但也存在一些關(guān)鍵的細(xì)節(jié)問(wèn)題。一方面，無(wú)菌水僅僅靠微電解儀尚不能達(dá)到持續(xù)無(wú)菌，輸水管路的科學(xué)配置是極其關(guān)鍵的因素，必須設(shè)置循環(huán)回路，使微電解的殺菌物質(zhì)在循環(huán)管路中持續(xù)保持。筆者了解到國(guó)內(nèi)目前約25家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用了微電解無(wú)菌水系統(tǒng)，另有2 家單位在嘗試應(yīng)用微電解系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)所制水不能達(dá)到無(wú)菌而放棄使用，究其原因是配置的輸水管路沒(méi)有設(shè)置循環(huán)回路、輸水管網(wǎng)有過(guò)長(zhǎng)過(guò)多盲端、輸水管網(wǎng)中形成旁通獨(dú)立閉環(huán)等，導(dǎo)致輸水管路死角和部分不能循環(huán)的水存在，管網(wǎng)中的水不能全部回流而重新進(jìn)入微電解殺菌循環(huán)系統(tǒng)中，從而導(dǎo)致水中細(xì)菌的滋生。因此，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施的設(shè)計(jì)規(guī)劃中，對(duì)無(wú)菌水系統(tǒng)中輸水管路的布局需要考慮循環(huán)輸水管路的設(shè)計(jì)，盡可能減少輸水死角。另一方面，目前的微電解無(wú)菌水系統(tǒng)沒(méi)有即時(shí)報(bào)警系統(tǒng)。本中心自2018年11 月起在系統(tǒng)中配置了在線(xiàn)微電解儀電流檢測(cè)表，以監(jiān)控微電解儀產(chǎn)生的電流，小于或等于2 A時(shí)應(yīng)立即停用，啟用備用機(jī)。此外，準(zhǔn)確判斷仍然需要取水樣進(jìn)行微生物檢測(cè)，歷時(shí)2～14 d才能報(bào)告結(jié)果，因此水質(zhì)微生物檢測(cè)結(jié)果的判斷遲于污染發(fā)生的實(shí)際時(shí)間。未來(lái)工作中，將考慮利用微電解水中的主要滅菌成分設(shè)置在線(xiàn)檢測(cè)報(bào)警系統(tǒng)以達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控的作用。