弓慧杰, 張光明

(1.四川省成都市新都區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌腎病血液內(nèi)科, 成都 610500; 2.西南醫(yī)科大學(xué)病理生理研究室, 瀘州 646000)

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)為腎臟纖維化，最終發(fā)展為終末期腎病，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因之一［1］。腎臟纖維化的病理生理變化是腎臟固有細(xì)胞被大量細(xì)胞外基質(zhì)取代，分泌大量炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，從而破壞腎臟正常結(jié)構(gòu)［1］。骨膜蛋白（periostin）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在侵襲、遷移及黏附能力明顯提高的細(xì)胞內(nèi)其表達水平明顯升高［2］。另外在以機體組織纖維化及遷移為特點的病理生理過程中，骨膜蛋白通過對膠原蛋白的調(diào)節(jié)，參與腎臟纖維化［3］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是引起腎臟損傷的重要炎性因子之一，也是單核巨噬細(xì)胞等分泌的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在腎臟纖維化進展過程中發(fā)揮重要的促進作用。利格列?。↖nagliptin）是一種二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑，通過高效地選擇性抑制DPP-4 來調(diào)節(jié)血糖，具有一定的腎臟保護作用［4］。本實驗以2 型糖尿病大鼠為研究對象，觀察腎組織纖維化過程中骨膜蛋白和TGF-β1 的表達變化，以及利格列汀是否會影響這兩個指標(biāo)的表達水平，為治療糖尿病腎病提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量為230～250 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［SCXK（川）2018-17］提供，動物質(zhì)量合格證號為川醫(yī)動字第2401115，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［SYXK（川）2018-065］的屏障環(huán)境。動物實驗經(jīng)西南大學(xué)動物福利倫理委員會審查批準(zhǔn)（文號：IACUC2018001592）。

1.1.2 實驗儀器

微型凝膠電泳儀（日本Mupid公司），全光譜酶標(biāo)讀數(shù)儀（10-240 VAC，美國Thermo 公司），紫外分光光度計（JC-UT2000型，成都光學(xué)儀器廠），凝膠圖像掃描系統(tǒng)（Tannon 2500 型，美國BioRad 公司），光學(xué)顯微鏡（AX-72型，日本Olympus光學(xué)儀器公司）。

1.1.3 主要試劑

利格列汀片（歐唐寧?，批號H20130865，美國Eli Lilly and Company 公司），TRIzol 試劑盒及RT-PCR試劑盒（成都市博瑞克生物技術(shù)有限公司），鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），SP 免疫組化檢測試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立及分組

24 只大鼠禁食不禁水12 h 后，稱其體質(zhì)量并腹腔注射60 mg/kg 的STZ，建立糖尿病模型。另外12 只SD大鼠注射等劑量的檸檬酸緩沖液，作為對照組。注射STZ 的大鼠48 h 后尾靜脈取血，測空腹血糖水平，血糖濃度≥16.7 mmol/L 的大鼠確定為造模成功。24 只大鼠均造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為糖尿病模型組及治療組，每組各12只。治療組大鼠予以利格列?。?0 mg·kg-1·d-1）持續(xù)灌胃12周，模型組及對照組予以等劑量的生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）灌胃相同時間。實驗期間各組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，12 周后3組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，開腹取腎臟備用。

1.2.2 腎臟切片HE染色觀察

將大鼠腎臟組織用4%甲醛溶液固定2～3 h后包埋并切片；切片置入蘇木精染液中5 min，自來水充分清洗后置于1%的鹽酸乙醇溶液中分化數(shù)秒，用自來水沖洗；再次將切片置入伊紅染液中染色5 min，充分清洗；再次將切片置于梯度乙醇溶液及無水乙醇中脫水5 min，放入二甲苯中透明5 min 后，用樹膠封固。光學(xué)顯微鏡（100倍、200倍）下觀察，拍照。

1.2.3 RT-PCR檢測腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

依據(jù)TRIzol 試劑盒說明書提取各組大鼠腎臟組織中RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，然后采用紫外分光光度法測定RNA的純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，分別得到模板單鏈cDNA 后進行PCR 反應(yīng)。骨膜蛋白上游引物序列為5′-GCTGGCACCTGTGAATA-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-TCTCCCTTGCTTACTCC-3′，目標(biāo)產(chǎn)物長度為252 bp；TGF-β1 基 因 上 游 引 物 序 列 為5′-TGGAAACGACC TTCTATGACGATG -3′，下游引物序列為5′-TGATGT GCCCGTTGCTGGAC-3′，目標(biāo)產(chǎn)物長度為195 bp。GAPDH上游引物序列為5′-CAACTCCCTCAAGATTGT CAGCAA-3′，下游引物序列為5′-GGCATGGACTGTG GTCATGA-3′，目標(biāo)產(chǎn)物長度為207 bp。PCR 反應(yīng)體系：dNTP原料混合液10 μL，轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RT-PCR增強劑0.25 μL，模板cDNA 5 μL，上下游引物各1 μL，無核酸酶水2.25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃30 s 變性，50 ℃10 s 退火，70 ℃30 s延伸，35個循環(huán)。反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離目的條帶，拍照。最終結(jié)果以目的基因與內(nèi)參GAPDH光密度的比值表示骨膜蛋白、TGF-β1的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1蛋白表達

將大鼠腎臟組織制作切片標(biāo)本，然后用磷酸緩沖鹽溶液清洗，冷丙酮4 ℃固定15 min 后，再次磷酸緩沖鹽溶液漂洗；3%去離子水室溫孵育15 min后血清封閉，37 ℃孵育15 min，加入兔抗鼠骨膜蛋白一抗或馬抗鼠TGF-β1 一抗（工作液體積稀釋比例分別為1∶200、1∶100），37 ℃孵育2 h；磷酸緩沖鹽溶液漂洗，加入山羊抗兔二抗或兔抗馬二抗（工作液體積稀釋比例分別為1∶50、1∶100），37 ℃孵育1 h；磷酸緩沖鹽溶液漂洗，加DAB顯色劑顯色。光學(xué)顯微鏡（400倍）下選取30 個隨機視野，攝影，然后使用IPP 軟件分析平均積分光密度（integral optical density，IOD），以此反映骨膜蛋白和TGF-β1蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行結(jié)果分析。各實驗的檢測結(jié)果數(shù)據(jù)均用-x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利格列汀抑制糖尿病模型大鼠的腎組織纖維化

HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果（圖1）顯示，對照組大鼠的腎小球分布相對密集，大部分呈橢圓形，外周光滑；血管球內(nèi)毛細(xì)血管分布也密集；腎小管的管腔光滑、規(guī)整。與對照組比較，糖尿病模型組大鼠的腎皮質(zhì)內(nèi)小葉間動脈、入球小動脈、弓形動脈的管壁明顯增厚，管腔明顯變小；細(xì)胞外基質(zhì)增多；有大量染色較深且核質(zhì)比例相對較大的炎性細(xì)胞浸潤，腎小管明顯擴展；腎小球出現(xiàn)萎縮，纖維化明顯。治療組較模型組的纖維化病變明顯減輕。

圖1 HE染色顯示各組大鼠腎臟組織病理學(xué)特征（×100，×200）Figure 1 The pathological characteristics in renal interstitium of rats detected by HE staining（×100，×200）

2.2 利格列汀抑制糖尿病模型大鼠的腎小管間質(zhì)病變

Masson 染色結(jié)果顯示，腎臟膠原著色主要位于Bowman囊、腎小球基底膜和腎小管微小血管周圍。與對照組相比，糖尿病模型組大鼠的腎間質(zhì)寬度增加，系膜基質(zhì)增生，腎小管管腔擴張，腎間質(zhì)深藍(lán)色膠原沉積顯著。治療組大鼠的腎小管間質(zhì)病變明顯輕于模型組（圖2）。

圖2 Masson染色顯示各組大鼠腎組織（×100，×200）Figure 2 The pathological characteristics in renal interstitium of rats detected by Masson staining（×100，×200）

2.3 利格列汀下調(diào)糖尿病模型大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 mRNA轉(zhuǎn)錄

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，糖尿病模型組大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031 5）；與糖尿病模型組比較，治療組糖尿病大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 mRNA表達水平明顯下降，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007 2）（圖3）。

圖3 RT-PCR法檢測各組大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 mRNA表達Figure 3 The expressions of periostin and TGF-β1 mRNA of in renal renal interstitium of rats detected by RT-PCR

2.4 利格列汀下調(diào)糖尿病模型大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1蛋白表達

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果（圖4）顯示，與對照組相比，糖尿病模型組大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGFβ1 表達水平偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003 8）；與糖尿病模型組相比，治療組糖尿病大鼠腎臟組織中骨膜蛋白和TGF-β1 表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.037 0）。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腎組織骨膜蛋白和TGF-β1的表達變化（DAB染色，×400）Figure 4 The expressions of periostin and TGF-β1 protein in renal renal interstitium of rats detected by immunohistochemistry（DAB，×400）

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病晚期出現(xiàn)的一種嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是臨床上糖尿病患者主要的死亡原因之一，患者死亡率遠(yuǎn)大于其他慢性腎臟病患者。腎臟纖維化是糖尿病腎病進展的主要特征，其表現(xiàn)為腎臟本身實質(zhì)細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)增多。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化進展與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其中TFG-β1 對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著重要作用［5］。因此，TGF-β1 及其下游的調(diào)節(jié)因子作為抗纖維化治療的有效靶標(biāo)，受到越來越多的關(guān)注［6］。TGF-β1 是一種具有多項調(diào)節(jié)功能的纖維形成生長因子，可誘導(dǎo)腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，在腎臟纖維化過程中起到關(guān)鍵決定性作用［7］。推測TGF-β1是糖尿病腎病纖維化過程中的核心因子，可通過促進腎臟實質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌合成并抑制降解，誘導(dǎo)腎臟實質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)，加速糖尿病腎病的發(fā)展。因此，研究糖尿病腎病纖維化進展機制并開發(fā)有效的阻斷藥物，成為了目前迫切需要探討的研究內(nèi)容之一。

骨膜蛋白作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以通過整聯(lián)蛋白受體產(chǎn)生粘附作用，并與多種膠原蛋白結(jié)合，促進Ⅰ型膠原蛋白、Ⅴ型膠原蛋白、肝素黏連蛋白等的分泌及成熟，參與糖尿病腎病纖維化［8］。骨膜蛋白是早期腎病腎小管損傷的敏感性生物標(biāo)志物，并且與糖尿病腎病的并發(fā)癥關(guān)系密切［9］。有文獻報告，受到損傷的急性腎小管上皮細(xì)胞中骨膜蛋白處于高表達狀態(tài)，Ⅰ型、Ⅲ膠原蛋白表達增加，推測骨膜蛋白可能通過某種途徑參與了Ⅲ膠原蛋白形成［11］；然而這一結(jié)論還需要通過后續(xù)的體內(nèi)外實驗進行驗證，例如將骨膜蛋白基因沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞，探討骨膜蛋白調(diào)控Ⅲ膠原蛋白的病理生理學(xué)機制。另外，推測TGF-β1 作為糖尿病腎病纖維化過程中的核心因子，可能通過正相關(guān)調(diào)控骨膜蛋白的表達水平，加速糖尿病腎病進展。本實驗結(jié)果證實，在糖尿病模型組中TGF-β1和骨膜蛋白及其mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05），提示兩個指標(biāo)之間有一定的相關(guān)性。

利格列汀是一種治療2型糖尿病的藥物，其作用模式是抑制胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）代謝。GLP-1 是一種腸促胰素，具有葡萄糖濃度依賴性。利格列汀還可以抑制胰高血糖素的釋放［11］。另外，利格列汀是一種DPP-4抑制劑，可能是治療2型糖尿病腎病的一種潛在的新型藥物［12］。有文獻報告，在糖尿病小鼠動物實驗中，DPP-4 治療后TGF-β1水平較對照組明顯下降，說明在2型糖尿病大鼠實驗中利格列汀不僅可以改善早期糖尿病腎病的血糖水平，而且還有保護腎臟功能及調(diào)節(jié)機體炎性狀態(tài)的作用，在早期糖尿病腎病的病情控制中發(fā)揮著重要作用［13］。本實驗結(jié)果表明，糖尿病腎病大鼠經(jīng)利格列汀干預(yù)后骨膜蛋白及TGF-β1 表達均明顯下調(diào)，對腎臟纖維化有一定保護作用，這與文獻［13］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本實驗中糖尿病模型組大鼠骨膜蛋白及TGF-β1均處于高表達狀態(tài)，而經(jīng)利格列汀治療后，骨膜蛋白和TGF-β1蛋白表達及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降。結(jié)合本實驗結(jié)果推斷，腹腔注射利格列汀可下調(diào)糖尿病小鼠腎臟中TGF-β1 水平，從而促進骨膜蛋白降解，延緩糖尿病腎臟纖維化的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果提示，TGF-β1可能是一個重要的調(diào)控因子，可能成為治療糖尿病腎病進展的作用靶點，為糖尿病腎病纖維化的預(yù)防和治療提供了新的思路。