楊競(jìng)，張光群，李明銳，湛方棟，李元，祖艷群，何永美

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

臭氧衰減導(dǎo)致的地表UV-B 輻射（280～315 nm）增強(qiáng)是當(dāng)今重大的全球氣候變化問(wèn)題之一[1]。UV-B輻射作為重要的環(huán)境因子之一，會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），顯著降低植物葉片光合色素含量、改變植株礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)含量、抑制抗氧化酶活性、阻礙抗氧化物質(zhì)合成、導(dǎo)致植株生物量下降[2]。在一定范圍內(nèi)，植物啟動(dòng)自身的防御機(jī)制，通過(guò)提高超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶活性[3]、增加酚類、類黃酮等抗氧化物質(zhì)含量來(lái)提高植物抗性[4]，以緩解UV-B的損傷[5-6]。氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子，施氮可提高植物抗性，也可改變植物對(duì)UV-B 輻射增強(qiáng)的響應(yīng)[7-8]。因此，研究UV-B 輻射和施氮對(duì)植物的影響顯得尤為重要，目前的研究主要集中在谷子、白菜、菠菜、藻類[9-10]等，對(duì)固氮植物滿江紅的相關(guān)研究報(bào)道較少。

滿江紅（Azolla imbricata）是蕨藻共生體，其生物量大、固氮量高，作為生物綠肥被廣泛使用[11]。滿江紅體內(nèi)的固氮藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacterium）通過(guò)固氮酶將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為可被利用的氨，供植物生長(zhǎng)發(fā)育，植物固氮酶極易被氧化，其活性直接決定著滿江紅的供氮能力[12-13]，顯著影響滿江紅參與稻田氮循環(huán)[14]。云南元陽(yáng)梯田紫外輻射背景值高，梯田不施加化肥，依靠滿江紅等還田維持稻田氮循環(huán)[15]，這為研究UV-B 輻射和氮素復(fù)合作用的影響提供上佳的試驗(yàn)材料。因此，以元陽(yáng)梯田稻田滿江紅為研究材料，UV-B 輻射和氮素作為影響因素，在項(xiàng)目組前期研究的基礎(chǔ)上，基于元陽(yáng)梯田的地域特點(diǎn)，研究UV-B 輻射和施氮單獨(dú)及復(fù)合作用對(duì)滿江紅生長(zhǎng)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和抗氧化生理的影響，為認(rèn)識(shí)元陽(yáng)梯田滿江紅對(duì)UV-B 輻射與氮素養(yǎng)分的生理響應(yīng)特征提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取云南元陽(yáng)梯田水稻生長(zhǎng)期（5—6 月）自然漂浮生長(zhǎng)的滿江紅植株，帶回試驗(yàn)室用蒸餾水沖洗數(shù)次，去除表面多余泥土和雜質(zhì)，備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

光源設(shè)置：5.0 kJ·m-2UV-B 輻射強(qiáng)度，采用李元等[16]建立的方法在試驗(yàn)小區(qū)水面垂直距離40 cm處懸掛UV-B 燈管（光譜為280～315 nm），燈管長(zhǎng)1.2 m，間距30 cm。自然光對(duì)照組只懸掛燈架不供應(yīng)燈管。光源和培養(yǎng)液設(shè)置見(jiàn)表1，其中氮含量0 g·L-1的處理采用無(wú)氮霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[17]，氮含量0.06 g·L-1的處理采用30%霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[18]。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Experiment settings

將備用滿江紅隨機(jī)接種至矩形塑料培養(yǎng)盆（31 cm×24 cm×11 cm）中連續(xù)水培18 d，接種量為水面面積的1/10，約3.0 g，每3 d 定量添加100 mL 蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)量，共4 組處理，每組處理5 個(gè)重復(fù)，共20 個(gè)小區(qū)。UV-B輻照時(shí)間為9：30—17：30（光暗周期為8 h∶16 h），大棚培養(yǎng)溫度（24±4）℃，相對(duì)濕度50%～70%。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在第12 天時(shí)，CK 處理滿江紅長(zhǎng)滿試驗(yàn)小區(qū)水面，因此，統(tǒng)一將采樣時(shí)間定為第12天。

1.3 生物量測(cè)定及生長(zhǎng)系數(shù)計(jì)算

采用鮮質(zhì)量稱量法，每3 d 取出全萍過(guò)40 目篩，用紙吸干表面水分后稱取鮮質(zhì)量，稱完后放回。按照公式（1）計(jì)算生長(zhǎng)系數(shù)（K）[19]：

式中：W0是初始放萍量，g；W是實(shí)際萍體的鮮質(zhì)量，g；t為間隔天數(shù)，d。

1.4 植株礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素測(cè)定

培養(yǎng)12 d 時(shí)取樣，于105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干24 h至恒質(zhì)量。采用凱氏定氮法測(cè)定總氮含量，鉬銻抗比色法測(cè)定全磷含量，火焰原子吸收分光光度法測(cè)定總鈣、總鎂含量[20]。

1.5 光合色素的測(cè)定

取鮮萍2 g 去根洗凈，加入95%乙醇5 mL，冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管。于轉(zhuǎn)速20 000 r·min-1離心10 min。取上清液在分光光度計(jì)波長(zhǎng)665、649 nm 和470 nm 處測(cè)定吸光度。參照文獻(xiàn)[20]計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。

1.6 抗氧化物質(zhì)和酶的測(cè)定

取鮮萍2 g 加入2 mL 的PBS 提取緩沖液[0.04 mol·L-1Na2HPO4，0.06 mol·L-1NaH2PO4，0.1%（V/V）Triton X-100，1 mol·L-1NaCl，10 g·L-1PVPP，pH：7.0]，在冰浴中研磨成勻漿。將勻漿移入離心管，另加1 mL的提取緩沖液，清洗研缽后也并入離心管中，混勻后于8 000 r·min-1離心15 min。取上清液置于分光光度計(jì)測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸（AsA）吸光度，具體波長(zhǎng)和計(jì)算公式參照南京建成生物工程研究所SOD、POD、MDA、CAT 和總抗氧化能力（FRAP 法）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。

取鮮萍1 g，在冰浴中研磨成勻漿，加入含1%鹽酸的甲醇溶液，提取24 h，取0.5 mL提取液，用蒸餾水定容至25 mL，在紫外分光光度計(jì)280、325 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚含量，在305 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算類黃酮含量[21]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）來(lái)表示，用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析和最小顯著差法（LSD）顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，以3 g 的初始放萍量記錄連續(xù)水培18 d 的生長(zhǎng)系數(shù)的變化。UV-B輻射和N處理導(dǎo)致滿江紅的生長(zhǎng)速率在1～18 d 內(nèi)均低于CK，在培養(yǎng)6 d 時(shí)生長(zhǎng)系數(shù)最高，9 d 時(shí)和12 d 時(shí)生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異，18 d 時(shí)生長(zhǎng)速率最低。CK 處理的滿江紅平均生長(zhǎng)系數(shù)為0.102，UV-B+N、UV-B和N處理的平均生長(zhǎng)系數(shù)低于CK 處理，分別為0.085、0.082 和0.080。UV-B+N、UV-B、N處理在各時(shí)期的K值均顯著低于CK處理，UV-B+N、UV-B 和N 處理在各時(shí)期K值無(wú)顯著差異。雙因素分析表明，UV-B輻射處理、N處理對(duì)滿江紅生長(zhǎng)系數(shù)有極顯著影響，且兩者存在交互作用。

圖1 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅生長(zhǎng)系數(shù)（K）的影響Figure 1 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on growth coefficient（K）of Azolla

由圖2 可知，以3 g 的初始放萍量記錄連續(xù)水培18 d的生物量變化。UV-B+N 處理、UV-B 輻射處理、N 處理在培養(yǎng)18 d 時(shí)滿江紅生物量均顯著低于CK，UV-B+N 處理在培養(yǎng)9、12、15、18 d時(shí)生物量下降，降幅分別為10.6%、16.8%、22.6%、34.8%。UV-B 處理在9、12、15、18 d 時(shí)生物量下降，降幅分別為19.8%、26.7%、27.7%、36.1%。N處理在9、12、15、18 d時(shí)生物量下降，降幅分別為19.8%、18.4%、21.3%、30.0%。四組處理均在培養(yǎng)12 d 時(shí)生物量最高。UV-B+N、UVB、N 處理在3～18 d 的生物量均顯著低于CK 處理，UV-B+N、UV-B 和N 處理在各時(shí)期生物量無(wú)顯著差異。雙因素分析表明，UV-B輻射處理、N處理對(duì)滿江紅生物量有極顯著影響，且兩者存在交互作用。

圖2 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅生物量的影響Figure 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on biomass of Azolla

2.2 UV-B 輻射和施氮對(duì)滿江紅礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

與CK 相比，UV-B+N、UV-B、N 處理均顯著增加了滿江紅N 含量，增幅分別為156.8%、136.1%、33.7%；UV-B+N 處理和N 處理顯著降低滿江紅的P、Mg、Ca 含量，降幅分別為20.8%、38.5%、37.1% 和4.2%、36.0%、37.5%。雙因素分析表明，UV-B、N處理對(duì)滿江紅N、Mg、Ca 含量有極顯著影響，且兩者存在交互作用。UV-B 處理對(duì)K 含量沒(méi)有顯著影響，三組處理均對(duì)滿江紅N含量影響顯著，且有交互作用?？芍猆V-B+N、UV-B 輻射、N 處理均使?jié)M江紅的N 含量增加，Mg、Ca含量減少（表2）。

表2 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響（mg·g-1）Table 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on the content of nutrients of Azolla（mg·g-1）

2.3 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅光合色素含量的影響

與CK 相比，UV-B+N 處理顯著降低了葉綠素a、類胡蘿卜素含量，降幅分別為21.9%、43.6%。UV-B處理顯著降低了葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，降幅分別為21.1%、37.3%、41.0%。N處理顯著降低了類胡蘿卜素含量，降幅為41.0%。UV-B輻射條件下葉綠素b含量的降幅大于葉綠素a的降幅。雙因素方差分析表明，UV-B 處理、N 處理對(duì)葉綠素a 和類胡蘿卜素含量有極顯著影響，且具有交互作用（表3）。

表3 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅光合色素含量的影響（mg·g-1）Table 3 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on photosynthetic pigment content of Azolla（mg·g-1）

2.4 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅抗氧化物質(zhì)含量的影響

與CK 相比，UV-B+N 處理顯著增加了總酚的含量，增幅為160.2%。UV-B 輻射使?jié)M江紅總酚和MDA 含量顯著增加86.7%、69.5%，使AsA、類黃酮含量顯著降低16.6%、57.8%。N 處理顯著增加了AsA含量，增幅為14.7%。雙因素方差分析表明，UV-B 處理和N 處理對(duì)MDA、AsA、類黃酮含量有顯著影響，且對(duì)總酚、類黃酮含量的影響具有交互作用。三組處理均導(dǎo)致MDA含量顯著增加（表4）。

表4 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅丙二醛與抗氧化物質(zhì)含量的影響Table 4 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on MDA and oxidation product content of Azolla

2.5 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅抗氧化酶的影響

與CK 相比，UV-B+N、UV-B 輻射、N 處理均顯著增加SOD 活性，增幅為164.7%、189.3%、185.0%。POD 活性顯著降低，降幅分別為8.17%、30.1%、29.4%，使GR 活性顯著增加85.9%、69.5%、53.2%，對(duì)CAT 活性無(wú)顯著影響。UV-B 輻射處理的總抗氧化能力是CK 的3 倍，N 處理使?jié)M江紅總抗氧化能力顯著提升82.1%。雙因素方差分析表明，UV-B 處理和N 處理對(duì)總抗氧化能力和SOD、POD、GR 活性有顯著影響，且具有交互作用（表5）。

表5 UV-B輻射和施氮對(duì)滿江紅抗氧化酶的影響Table 5 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on antioxidant enzymes of Azolla

2.6 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果（表6）顯示，UV-B 輻射和N 處理的滿江紅生物量與類胡蘿卜素、類黃酮含量呈顯著正相關(guān)，與總氮、總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)。滿江紅總氮含量與AsA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與類黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與MDA、總酚含量呈極顯著正相關(guān)。滿江紅總抗氧化能力與AsA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與總酚含量呈極顯著正相關(guān)。

表6 滿江紅生物量、總氮含量與抗氧化物質(zhì)及光合色素含量的相關(guān)性分析Table 6 Correlation between biomass，total nitrogen，oxidation products and photosynthetic pigment of Azolla

3 討論

3.1 滿江紅生長(zhǎng)對(duì)UV-B輻射響應(yīng)的機(jī)理

生物量是所有生理、生化和生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)期積累響應(yīng)[2]。UV-B輻射抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育及生物量[22]。本研究中，UV-B 輻射（5.0 kJ·m-2）處理使?jié)M江紅的生長(zhǎng)速率和生物量都低于對(duì)照組，在培養(yǎng)6～12 d 生長(zhǎng)速率呈負(fù)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)系數(shù)下降，表明UV-B 輻射縮短了滿江紅的生長(zhǎng)周期，這與PRASAD 等[23]的研究結(jié)果一致。N 處理導(dǎo)致滿江紅磷、鉀含量顯著減少，而UV-B 輻射處理與CK 無(wú)顯著差異，可能施氮會(huì)對(duì)滿江紅磷脂、磷酸合成和滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程造成不利影響[24]，這與試驗(yàn)中觀察到的滿江紅變黃和葉片萎縮的現(xiàn)象一致。UV-B+N、UV-B、N處理均導(dǎo)致滿江紅鈣、鎂含量顯著減少，這可能是滿江紅的應(yīng)激反應(yīng)，不利于滿江紅葉綠素的合成。UV-B+N、UV-B、N 處理均導(dǎo)致氮含量顯著增加，該結(jié)果與大多數(shù)研究不同，滿江紅氮含量與根部吸收作用和生物固氮作用有直接關(guān)系，是由于UV-B 輻射和施氮促進(jìn)了滿江紅的氮吸收或固氮作用，這與滿江紅品種以及施氮量和時(shí)間有關(guān)。根部吸收和生物固氮過(guò)程與滿江紅氮代謝過(guò)程有關(guān)。

生長(zhǎng)在不同氮濃度條件下的植物葉片光合作用對(duì)UV-B 輻射的響應(yīng)程度不同[25]，本試驗(yàn)中UV-B、UV-B+N 處理顯著減少滿江紅光合色素含量，N 處理下光合色素含量無(wú)顯著變化，葉綠素a/b發(fā)生變化，使葉綠體的膜發(fā)生氧化作用，破壞葉綠體的膜結(jié)構(gòu)[26]。本試驗(yàn)中施氮未能緩解這些損傷，這可能與滿江紅生育期和UV-B 輻射強(qiáng)度有關(guān)。綜上，UV-B 輻射導(dǎo)致滿江紅礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量的變化，使?jié)M江紅基礎(chǔ)生理代謝受阻[27]，同時(shí)光合作用可能受到抑制，施氮未能緩解UV-B 輻射給植物帶來(lái)的損傷，最終導(dǎo)致生物量下降。

3.2 滿江紅抗氧化代謝對(duì)UV-B輻射響應(yīng)的機(jī)理

UV-B 輻射對(duì)滿江紅最重要的影響是誘導(dǎo)其產(chǎn)生過(guò)量活性氧（ROS）進(jìn)而損傷質(zhì)膜。同時(shí)，UV-B 輻射也會(huì)激活植物體內(nèi)的兩類抗氧化機(jī)制[28]：一種是抗壞血酸（AsA）、類胡蘿卜素、酮類、酚類等抗氧化物質(zhì)的非酶促反應(yīng)，另一種是SOD、CAT、POD 和GR 的酶促反應(yīng)。這些抗氧化酶和物質(zhì)相互協(xié)調(diào)、相互作用，以緩解UV-B輻射給植物帶來(lái)的損傷[29]。

MDA 是植物過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，它間接反映了生物膜受損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，UV-B+N、UV-B、N 處理的MDA 含量均顯著上升，且與生物量呈顯著負(fù)相關(guān)，與總氮含量呈極顯著正相關(guān)，這與相關(guān)研究結(jié)果[30]一致，滿江紅生物量下降與質(zhì)膜受損程度有關(guān)。本研究中UV-B、UV-B+N 處理導(dǎo)致總酚含量顯著增加，這與大多數(shù)研究相同，是滿江紅抗性的表現(xiàn)。而N 處理導(dǎo)致AsA 含量顯著增加，AsA 與總氮、總抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān)，與生物量無(wú)顯著相關(guān)性，AsA 與谷胱甘肽（GSH）、GR 等物質(zhì)協(xié)同作用形成抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，可以清除ROS，UV-B+N、UV-B、N 處理均導(dǎo)致GR 活性顯著增加，GR 能有效維持AsA-GSH 循環(huán)，但這不僅需要GR，還需要GSH 底物合成[31]。AsA-GSH 循環(huán)過(guò)程較復(fù)雜，要解釋AsA 在N 處理下的含量增加還需進(jìn)一步對(duì)該循環(huán)的其他物質(zhì)和酶進(jìn)行研究。UV-B+N、UV-B、N 處理均顯著減少類黃酮的含量，類黃酮含量與生物量呈顯著正相關(guān)，與總氮含量顯著負(fù)相關(guān)，這可能是由于UV-B 輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 超出了滿江紅活性氧清除能力，對(duì)滿江紅葉片造成了進(jìn)一步損傷。

SOD在氧化應(yīng)激防御中起核心作用，其作用是將O2-轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，CAT 能催化H2O2，其轉(zhuǎn)化率高，UV-B 輻射對(duì)CAT 活性的影響取決于其強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間[32]。與其他類似研究相同[33]，UV-B 輻射和施氮均導(dǎo)致滿江紅體內(nèi)SOD、GR 活性提高，SOD 活性的顯著增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致滿江紅O2-轉(zhuǎn)化為O2和H2O2的轉(zhuǎn)化率過(guò)高，部分H2O2可能會(huì)在體內(nèi)累積。與大多數(shù)研究不同，本研究中UV-B、N 處理的滿江紅POD 活性顯著下降，可能與滿江紅POD 對(duì)UV-B 輻射的敏感度有關(guān)[34]。一方面，UV-B 輻射激發(fā)了滿江紅的抗氧化代謝，使總酚含量顯著增加，且施氮增加AsA含量，一定程度提升了滿江紅抗氧化能力。另一方面，SOD活性的提高程度可能超過(guò)了POD、CAT 對(duì)H2O2的轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致H2O2累積并造成氧化損傷[35]，同時(shí)MDA 含量的顯著上升也說(shuō)明滿江紅受到了氧化損傷。

綜上，UV-B 輻射引起了滿江紅的氧化應(yīng)激反應(yīng)，H2O2、-OH 和O2可能在滿江紅體內(nèi)累積，UV-B+N處理對(duì)兩種抗氧化機(jī)制都有所激發(fā)，總抗氧化能力顯著提高；UV-B 輻射提高滿江紅抗氧化酶活性；施氮增加AsA 含量，總抗氧化能力顯著增強(qiáng)，植物抗性增強(qiáng)；UV-B+N、UV-B、N處理可能均導(dǎo)致滿江紅質(zhì)膜不同程度的損傷，而滿江紅抗氧化物質(zhì)的含量增加利于其對(duì)生物量的累積，抗氧化酶活性的提高有利于其總抗氧化能力增強(qiáng)。滿江紅總氮含量與MDA 含量顯著正相關(guān)，推測(cè)滿江紅的氮累積可能是由濃縮效應(yīng)造成的。UV-B 輻射增強(qiáng)和施氮對(duì)滿江紅抗氧化機(jī)制的影響較復(fù)雜，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）UV-B 輻射和施氮處理均顯著增加滿江紅氮含量，均顯著降低鈣、鎂含量，對(duì)鉀含量無(wú)顯著影響。UV-B 輻射和UV-B 輻射+施氮處理使葉綠素a 和類胡蘿卜素含量顯著下降。

（2）UV-B輻射處理使?jié)M江紅MDA、總酚的含量增加，SOD、GR活性提高。施氮處理顯著增加AsA含量，UV-B 輻射、施氮處理均使?jié)M江紅總抗氧化能力顯著提升。

（3）UV-B 輻射和施氮抑制滿江紅生長(zhǎng)速率，降低其生物量，施氮未能緩解因氧化損傷造成的生長(zhǎng)速率下降和生物量減少。