楊天宇 馬曉宇 貢笑笑 彭 程 黃 杰 趙國(guó)琦,2,3 詹 康*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

犢牛時(shí)期是奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中重要環(huán)節(jié)，犢牛生長(zhǎng)性能受飼料成分和飼喂方式等多種因素的影響[1]。提供合理的日糧不僅可以提高飼糧的利用率，還可提高其成年后的總體發(fā)育水平。因此，犢牛培育是提高牛群品質(zhì)和創(chuàng)建高產(chǎn)奶牛群的關(guān)鍵。以前奶牛營(yíng)養(yǎng)研究關(guān)注點(diǎn)主要在泌乳奶牛，而近些年來(lái)，更多的研究集中在幼齡反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面[2]。

葡萄糖作為體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)單糖，是動(dòng)物體內(nèi)唯一可以通過(guò)血漿和細(xì)胞循環(huán)于全身的碳水化合物，參與多種細(xì)胞功能[3]。在反芻動(dòng)物中，循環(huán)葡萄糖的90%～100%均來(lái)自糖異生。此外，調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物糖異生是改善動(dòng)物健康、生長(zhǎng)與生產(chǎn)性能的有效手段[3]。糖異生在犢牛生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。犢牛出生后經(jīng)歷的一個(gè)關(guān)鍵適應(yīng)過(guò)程是：從子宮中葡萄糖、乳酸、氨基酸和脂肪酸獲取能量，轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾囉谌樘?、蛋白質(zhì)和脂肪通過(guò)消化轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰被岷椭舅岖@取能量[5-6]。Elwyn等[7]研究表明，在消化蛋白的過(guò)程中，肝臟通過(guò)門(mén)靜脈吸收多余氨基酸為糖異生儲(chǔ)備糖原。與單胃動(dòng)物不同，反芻動(dòng)物從腸道中吸收的葡萄糖很少，都不同程度地依賴氨基酸作為糖異生底物產(chǎn)生葡萄糖。處于生長(zhǎng)階段的反芻動(dòng)物需要大量的氨基酸通過(guò)糖異生途徑合成葡萄糖[8]。此外，參與糖異生途徑的關(guān)鍵限速酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)。提高肝糖異生與PCK和PC的表達(dá)增加有關(guān)[9-10]。此外，PC負(fù)責(zé)將線粒體中的丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，其啟動(dòng)子是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC1A)的活化而被轉(zhuǎn)錄激活[11]；PGC1A可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵的線粒體基因，這些基因有助于促進(jìn)糖異生途徑[12]。而FBP1酶催化果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸。Wang等[13]研究表明，F(xiàn)BP1酶活性的降低會(huì)導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量的下降。葡萄糖異生的最后一步，即G6PC酶催化葡萄糖6-磷酸，是葡萄糖從肝細(xì)胞釋放的必要步驟[14]。

日糧中蛋白質(zhì)是犢牛獲取氨基酸最重要的途徑。蛋白質(zhì)是影響犢牛生長(zhǎng)性能的重要因素。飼糧中蛋白質(zhì)水平對(duì)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、氮代謝、瘤胃發(fā)育有著促進(jìn)作用[15]。前人研究表明日糧中蛋白水平在18%～21%可提高反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、采食量和蛋白利用率[16-17]。液體和固體是犢牛飼料兩種形態(tài)。顆粒料既提供了均衡的營(yíng)養(yǎng)成分，又可以直接進(jìn)入瘤胃，促進(jìn)瘤胃的發(fā)育[18]，同時(shí)也為成年時(shí)期提供了良好營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的前提[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)21.02%的蛋白水平更有利于5月齡公犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育[20]。

之前的研究均集中在不同蛋白水平對(duì)荷斯坦公犢牛生長(zhǎng)性能的影響，而不同蛋白水平全價(jià)顆粒料能否對(duì)荷斯坦公犢牛糖異生途徑產(chǎn)生影響？因此，本研究旨在探究不同蛋白水平全價(jià)顆粒日料對(duì)5～6月齡荷斯坦公犢牛糖異生影響，以為進(jìn)一步探究高蛋白水平全價(jià)顆粒料對(duì)犢牛糖異生途徑的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年4月—2017年6月在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場(chǎng)進(jìn)行，選擇月平均月齡為5月齡，體重(172.80±7.16) kg 10頭荷斯坦公犢牛(隨機(jī)分為2組，每組5頭。試驗(yàn)每組分別添加蛋白含量為15.05% 和21.02%的犢牛全價(jià)顆粒料，15.05%的犢牛全價(jià)顆粒料記為L(zhǎng)P及21.02%的犢牛全價(jià)顆粒料記為HP組，自由飲水。按試驗(yàn)牛體重的3%進(jìn)行飼喂。通過(guò)每周更改一次顆粒料的飼喂量，確保LP與HP組犢牛的干物質(zhì)飼喂量基本一致。試驗(yàn)分為預(yù)試期和正試期，預(yù)試期7 d，正試期56 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將所有供試牛，在禁食(自由飲水)24 h后進(jìn)行屠宰，收集3 g肝臟到2 mL離心管，迅速放入液氮中，回到實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱凍存。

試驗(yàn)期間，日糧采用全價(jià)顆粒料，自由采食，營(yíng)養(yǎng)需要參照NRC(2001)。全價(jià)顆粒營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 全價(jià)顆粒料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient level of whole grain (DM basis)

1.2 樣本采集

在正試期第56 天，于晨飼5 h后，在犢牛頸部頸靜脈使用真空采血管進(jìn)行采血，采血量約為20 mL，在真空采血管中(無(wú)抗凝劑)轉(zhuǎn)入5 mL血樣，靜置30 min，3 500 r/min 15 min離心，制備的血清樣品于-80 ℃冰箱中保存。

試驗(yàn)結(jié)束后，共10頭試驗(yàn)公犢牛，在禁食(自由飲水)24 h后進(jìn)行屠宰，收集3 g肝臟，迅速放入液氮中，回到實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱凍存。

1.3 肝臟和血清中葡萄糖的測(cè)定

精確稱取50 mg肝臟組織放入離心管后，加入250 μL裂解液，用電動(dòng)勻漿器勻漿破碎組織，勻漿后室溫靜置10 min。取230 μL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，取剩下的裂解液用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定。

制備好的血清樣品和肝臟裂解液，采用葡萄糖試劑盒(購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司)測(cè)定葡萄糖(GLU)。

1.4 肝臟中氨基酸測(cè)定

稱取肉樣70 mg，加500 μL 6 mol/L HCL，勻漿60 s。將其轉(zhuǎn)移至20 mL安瓿瓶，2 mL 6 mol/L HCL清洗勻漿器，然后使用6 mol/L HCL定容至10 mL。放-20 ℃冰箱5 min，氮吹儀去掉空氣，酒精噴燈封口。在110 ℃下水解24 h，1 h后搖動(dòng)一次；24 h后拿出冷卻至室溫，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，使用超純水定容后搖勻。用0.22 mm水相濾膜過(guò)濾1 mL取500 μL至1.5 ml離心管中，氮吹儀吹干。200 μL 0.1 mol/L HCL 溶解，漩渦震蕩。加20 μL 正亮AA,加100 μL三乙氨已膘溶液，加100 μL 衍生試劑c異硫睛酸苯芷，混勻，室溫靜置1 h。加正己烷400 μL，漩渦震蕩，室溫15 min。取下層液體，0.22 mm濾膜過(guò)濾后，取200 μL濾液+800 μL超純水。最后取10 μL上樣。譜柱：SunFireTM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)裝有SunFireTM C18保護(hù)住(4.6 mm×20 mm, 5 μm)；流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸鈉乙腈溶液(93∶7)，pH 6.5；流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-超純水溶液，比例為80∶10∶10；梯度洗脫，程序見(jiàn)表1，流速0.7 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。測(cè)定肝臟中17種氨基酸。

1.5 肝臟總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

稱50 mg肝臟組織于1.5 mL離心管，按照總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國(guó))提取總RNA。最后，取1 μL提取的樣品進(jìn)行總RNA濃度和純度的測(cè)定。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s；PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品都有3個(gè)重復(fù)。

1.6 Real-time PCR

熒光定量PCR反應(yīng)配置總體系為20.0 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10.0 μL；10 μmol/L 的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL；Water PCR grade 6.4 μL；cDNA 2.0 μL。引物詳情見(jiàn)表2。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品都有3個(gè)重復(fù)。計(jì)算方法按照2-ΔΔCt。因?yàn)樵谀膛Ｖ懈视腿?磷酸脫氫酶(GAPDH)基因穩(wěn)定性高。因此，以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)μ钱惿P(guān)鍵的mRNA表達(dá)進(jìn)行歸一化處理。

表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 Information of reverse-transcription PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。運(yùn)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響

不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。與低蛋白組相比，高蛋白組極顯著提高(P<0.01)肝臟中的葡萄糖含量，同時(shí)也顯著提高(P<0.05)血清中葡萄糖含量。

表3 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響Table 3 Effects of protein at different concentrations on glucose content in serum and liver of Holstein bull calves

2.2 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛肝臟氨基酸含量的影響

采用液相色譜的方法檢測(cè)犢牛肝臟中氨基酸的含量見(jiàn)表4。與低蛋白組相比，高蛋白組顯著提高(P<0.05)Asp、Ala、Ser、Leu、Lys、Phe、Ile、Val、Tyr、Arg、Glu和His的含量，極顯著提高(P<0.01)Gly和Pro的含量，但未改變Thr和Met的含量。

表4 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛肝臟氨基酸含量的影響Table 4 Effects of protein at different concentrations on amino acidscontent in liver of Holstein bull calves mg/g

2.3 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛肝臟糖異生關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響

采用qRT-PCR分別檢測(cè)PCK1、PCK2、PC、FBP1、G6PC和PGC1A在不同蛋白水平日料飼喂?fàn)倥５母闻K中的表達(dá)變化(表5)。與高蛋白組相比，高蛋白組顯著提高了(P<0.05)PCK2、PC和PGC1A基因表達(dá)量，極顯著提高了(P<0.01)PCK1基因表達(dá)量，其他基因無(wú)顯著差異。

表5 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛肝臟糖異生途徑關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響Table 5 Effects of protein at different concentrations on mRNA expression of key genes of gluconeogenesis pathway in liver of male calves

3 討論與結(jié)論

糖異生對(duì)犢牛生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用[4]。尤其在進(jìn)食后，當(dāng)代謝產(chǎn)物大量流入血液時(shí)，糖異生起著至關(guān)重要的角色[22]。通過(guò)氨基酸轉(zhuǎn)成為葡萄糖是糖異生經(jīng)典途徑之一[23]。除了賴氨酸和亮氨酸外，其他的氨基酸都可以通過(guò)糖異生途徑生成糖。在維持飼養(yǎng)水平的反芻動(dòng)物中，內(nèi)源性葡萄糖最少有15%是由氨基酸轉(zhuǎn)化而來(lái)的，來(lái)自肝臟攝取的氨基酸占32%。在生長(zhǎng)階段的反芻動(dòng)物，需要大量的氨基酸去合成葡萄糖維持生長(zhǎng)發(fā)育[24]。而日糧中蛋白質(zhì)是氨基酸的最重要來(lái)源。以往的研究主要集中在不同水平蛋白日糧對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、血清生化和瘤胃發(fā)酵的影響，但不同水平蛋白日糧對(duì)犢牛糖異生的影響尚不清楚。因此本研究旨在不同蛋白水平全價(jià)顆粒日糧對(duì)犢牛糖異生的影響。

在正常飼養(yǎng)水平下，反芻動(dòng)物血糖濃度總是維持在一定的恒定范圍之內(nèi)，這對(duì)維持機(jī)體各組織細(xì)胞的能耗和功能發(fā)揮著重要作用。外源葡萄糖的吸收和內(nèi)源性糖異生作用都對(duì)血糖濃度有影響，而內(nèi)源性糖異生作用主要來(lái)自肝糖異生[25]。本課題組前期研究表明[20]，高蛋白組會(huì)提高3 h血清中葡萄糖含量，但顯著不差異。李輝等[26]研究表明，22%蛋白水平也可提高犢牛血糖含量。低蛋白組由于采食的日糧水平較低，犢牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力較差，難以提供足夠的葡萄糖。本研究表明，日糧中高水平蛋白(21.02%)可以顯著提高犢牛5 h血清葡萄糖和屠宰后肝臟葡萄糖含量。這可能是蛋白質(zhì)消化為氨基酸在肝臟通過(guò)糖異生作用促進(jìn)血糖提高的原因。但是關(guān)于犢牛的氨基酸肝臟糖異生研究很少有報(bào)道。肝臟是氨基酸主要代謝的場(chǎng)所。除了賴氨酸和亮氨酸外的18種常見(jiàn)氨基酸均可以通過(guò)糖異生途徑生成葡萄糖。本研究中發(fā)現(xiàn)，除了蘇氨酸和蛋氨酸以外，21.02%蛋白水平組增加了肝臟中其他氨基酸的含量。

糖異生途徑包含4種關(guān)鍵的限速酶，即PC、PCK、FBP1和G6PC。草酰乙酸是由PC編碼的酶催化線粒體中丙酮酸得來(lái)的，提供糖異生中間體補(bǔ)充所需的草酰乙酸。在糖異生作用的增加時(shí)候，PC的mRNA表達(dá)被促進(jìn)以響應(yīng)來(lái)自糖原性AA和乳酸的草酰乙酸[9]。本研究表明，與低蛋白組組相比，高蛋白組組可以顯著提高PC的mRNA表達(dá)量。蘋(píng)果酸是草酰乙酸在線粒體蘋(píng)果酸脫氫酶的還原作用下生成的，并輸出到細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中蘋(píng)果酸脫氫酶氧化作用后再次生成草酰乙酸。PCK1和PCK2酶分別催化草酰乙酸在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中形成磷酸烯醇式丙酮酸。在細(xì)胞中，磷酸烯醇式丙酮酸是由PCK1催化草酰乙酸產(chǎn)生，這是糖異生的關(guān)鍵反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白組可顯著促進(jìn)PCK1的mRNA表達(dá)量。先前的研究報(bào)道表明，氨基酸進(jìn)入糖異生是由PC和PCK1編碼的酶調(diào)節(jié)的，而不是PCK2，因?yàn)榘被嵝纬闪姿嵯┐际奖嵝枰诎麧{中獨(dú)立合成NADH[27]。PC和PCK1的 mRNA表達(dá)量的增加，進(jìn)一步暗示了飼喂高蛋白可促進(jìn)肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸濃度增加，進(jìn)而滿足下一步糖異生反應(yīng)。盡管以氨基酸作為前體物質(zhì)的糖異生并不依賴PCK2，但是PCK2也在糖異生發(fā)揮著重要的作用。在單胃動(dòng)物的肝臟中，PCK2只占總磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的大約1%～5%[28]，但在反芻動(dòng)物中PCK1和PCK2的活性大致相等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白組可顯著促進(jìn)PCK2的mRNA表達(dá)量。FBP1和G6PC的功能是催化果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰１M管本研究顯示，高蛋白組并未有顯著的提高FBP1和G6PC的mRNA的表達(dá)量。先前的研究表明，高蛋白飲食增加了肝臟中PCK的活性，但對(duì)G6PC的活性影響不大[29-30]。PGC1A作為一種調(diào)節(jié)與能量代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄輔激活物[31]。此外，PGC1A還參與糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá)，通過(guò)提高PCK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性去提高肝臟中的PCK的表達(dá)水平。與低蛋白組相比，高蛋白組顯著提高了PGC1A的mRNA表達(dá)量。此外，Dai等[32]研究發(fā)現(xiàn)高水平的氨基酸可以提高肝臟糖異生基因的表達(dá)和氨基酸的利用效率。本研究表明，日糧中高蛋白水平可以提高肝臟中氨基酸豐度同時(shí)增加肝臟糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)糖異生生成葡萄糖提供機(jī)體所需的能量。