張春梅 張海燕,2 劉忠錦 袁齊宏 陳春榮

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161042；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的漸行性神經(jīng)類(lèi)退行性疾病〔1〕。臨床上以執(zhí)行功能障礙、失認(rèn)、失用、失語(yǔ)、記憶障礙等表現(xiàn)為主要特征〔2,3〕。其最初表現(xiàn)為獲得性知識(shí)喪失、進(jìn)行性記憶力減退〔4〕，最終可發(fā)展為完全喪失日常生活的活動(dòng)能力〔5〕，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān),但是AD的病因迄今為止未明確〔6〕。

鹿茸是雄鹿未發(fā)生骨化的密生茸毛觸角，其中包括馬鹿和梅花鹿〔7〕。鹿茸屬于珍貴的藥材，其主要功效是益精補(bǔ)血、強(qiáng)筋健骨及溫腎壯陽(yáng)等。鹿茸含有大量的氨基酸、脂類(lèi)物質(zhì)、糖類(lèi)化合物、無(wú)機(jī)鹽及蛋白質(zhì)〔8,9〕。其中糖類(lèi)及蛋白類(lèi)是研究較多的成分。目前，研究學(xué)者們對(duì)鹿茸的藥理研究尚未針對(duì)確切的活性成分，仍停留在獲得粗提物的提取階段〔10,11〕。有研究推測(cè)鹿茸的生物學(xué)功能主要由蛋白質(zhì)決定〔12〕。多肽類(lèi)化合物在生命進(jìn)程中扮演十分重要的作用〔13〕，本研究探討鹿茸多肽(VAP)32對(duì)AD的治療作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑 SH-SY5Y細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；鼠抗人BACE1與ADAM10單克隆一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；相應(yīng)二抗購(gòu)自碧云天公司；雙抗、DMEM和磷酸鹽緩沖液(PBS)等試劑均購(gòu)自天津標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；p-JNK基因的相關(guān)引物設(shè)計(jì)購(gòu)自天津賽默飛公司。

1.2SH-SY5Y培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)溫度為37℃,CO2濃度為5%。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)基中加入雙抗。顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到視野下的80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。大概2 d傳代1次。傳代時(shí)吸除培養(yǎng)基，并用Hanks液沖洗1次，之后用1 ml胰酶進(jìn)行消化1 min，后用細(xì)胞培養(yǎng)液再清洗1次，然后加入1 ml培養(yǎng)基將貼壁細(xì)胞吹吸下來(lái)，將細(xì)胞以1傳2或1傳3置于培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建AD模型 將細(xì)胞隨機(jī)分為正常(NOR)組、誘導(dǎo)(MOD)組及VAP32組。以Aβ25～35(4.0 μg/ml)誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞，之后四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，作為MOD組。以VAP32作用被染毒的SH-SY5Y細(xì)胞作為多肽給藥組，后用試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活力及細(xì)胞凋亡情況。

1.4VAP32的提取純化 以鹿茸為原料，小心去掉鹿角的絨毛，把鹿角鋸成碎片，再把其研磨為顆粒。以水為溶劑，將超聲提取與乙醇沉淀相結(jié)合。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白含量，固液比(1∶10)，提取3次，30 min/次。水提后醇沉VAP，乙醇濃度為65%，沉淀4 h。后用三聚氰胺凝膠電泳分析顯示9條高分辨率條帶。然后用不同的MFL-B膜(PP-100、PS-50、HPS10、HPS-5、HPS-3)在不同濃度溶液中分離純化不同分子量的VAP。選擇分子量為3.2 kD的多肽。最后冷凍干燥。收集凍干粉。

1.5RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定基因表達(dá)量 使用軟件設(shè)計(jì)β-actin和SATB2上下游引物序列，選取長(zhǎng)度小于150 bp的片段。RNA提?。簩⒏鹘M細(xì)胞加入吹吸到離心管后，加入Trizol試劑，離心后取上清，加入氯仿繼續(xù)離心取上清，之后加入異丙醇，棄掉上清取沉淀，后用DEPC水溶解，于PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。上樣：將50×TAE 稀釋為1× TAE 溶液作為溶劑，稱(chēng)取0.48 g瓊脂糖，加入到1×TAE溶液中。微波爐加熱煮沸后加入5 μl的核酸染料，搖晃混勻。最后將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入4 μl DNA Maker 及目的基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。P-JNK：上游引物序列：5′-CCACCTAGTAGTGTGATAGA-3′，下游引物序列：5′-ACGTCGCTAGAAGGACTGG-3′；β-actin上游引物序列：5′-CGATACGTCAGTAGCAATGG-3′，下游引物序列：5′-GGTCGACGTCTGCAGCAACA-3′。

1.6Western印跡測(cè)定蛋白含量 4℃ PBS洗滌各組細(xì)胞2～3次，收集后10 000 r/min離心，離心后移去上清液加入10 ml放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)冰上裂解15 min后離心15 min取上清。用考馬斯法檢測(cè)各管吸光值，將各組蛋白濃度調(diào)至同樣后進(jìn)行蛋白上樣。上樣條件為：80 V，30 min；120 V，30 min。轉(zhuǎn)膜后，對(duì)應(yīng)marker收集不同分子量的NC膜，把NC膜放入到預(yù)先標(biāo)記好的平皿后，再添加脫脂奶粉并在搖床暗處封閉1 h。棄去奶粉后取出NC膜置于PBST中沖洗3次后，從左至右加入1 ml經(jīng)1∶1 000倍數(shù)PBS稀釋的鼠抗人BACE1與ADAM10一抗，于4℃下孵育過(guò)夜。第2天取出NC膜，于TBST溶液中洗滌4次后加入1∶1 000倍稀釋的鼠抗兔2抗溶液孵育1 h后于TBST溶液中洗滌4次。最后配制發(fā)光液1.5 ml,a液和b液按1∶1的比例現(xiàn)用現(xiàn)配，由左至右緩慢滴加到膜上，每個(gè)膜滴加150 μl發(fā)光液，后轉(zhuǎn)移到暗室進(jìn)行膠片沖洗。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.1軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度VAP32對(duì)細(xì)胞活力的影響 0、50、100、200 μg/ml VAP32加入后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的活力〔(91.28±2.47)%、(90.64±4.53)%、(88.29±3.58)%、(87.65±5.27)%〕略有變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明VAP32對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)毒性。

2.2不同濃度VAP32對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 3組細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)，均顯著升高(均P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)，MOD組細(xì)胞凋亡率均顯著高于NOR組和VAP32組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。表明VAP32對(duì)AD模型細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.3各組細(xì)胞SOD、MDA水平比較 與NOR組比較，MOD組SOD水平顯著下降，而MDA水平顯著上升(均P<0.05)。與MOD組比較，VAP32組SOD水平顯著上升，而MDA水平顯著下降(均P<0.05)。見(jiàn)表2。表明VAP32能抑制Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞SOD及MDA變化，減少氧化應(yīng)激損傷。

表2 各組氧自由基水平比較

2.4各組p-JNK基因表達(dá)水平比較 與NOR組、p-JNK基因表達(dá)水平(0.23±0.01)比較，MOD組(1.00±0.04)顯著升高(P<0.05)，與MOD組比較，VAP32組(0.59±0.02)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1。表明JNK通路參與Aβ25～35誘導(dǎo)的AD。而VAP32可抑制這一誘導(dǎo)。

2.5各組BACE1和ADAM10蛋白表達(dá)水平比較 與NOR組BACE1表達(dá)水平比較，MOD組顯著升高，與MOD組比較，VAP32組顯著下降(P<0.05)。與NOR組ADAM10表達(dá)水平比較，MOD組顯著下降，與MOD組比較，VAP32組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)p-JNK基因表達(dá)

表3 各組BACE1和ADAM10 蛋白表達(dá)水平比較

圖2 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中BACE1和 ADAM10蛋白表達(dá)情況

3 討 論

AD屬于神經(jīng)性的疾病，是由血管或神經(jīng)損害引起社會(huì)適應(yīng)能力的降低，是持續(xù)性的神經(jīng)活動(dòng)功能障礙。AD會(huì)影響患者思維記憶及分析判斷能力，嚴(yán)重影響老年患者身心健康〔14〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)際上AD患者已超過(guò)3 500萬(wàn)，且患病人數(shù)直線升高〔15〕。AD患者常見(jiàn)的病理特征是腦神經(jīng)的細(xì)胞外會(huì)形成老年斑(淀粉樣蛋白斑塊)，而Aβ的含量常與AD嚴(yán)重程度相關(guān)〔16〕。

鹿茸中含有大量的功效成分，而多肽又是其比重比較大的組分，以往的多肽類(lèi)研究都集中在多肽的混合物上，而對(duì)純品多肽的研究較少〔17〕，本研究純化出分子量為32 kD的單一多肽，發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的AD抑制作用，這在國(guó)內(nèi)外研究中較為少見(jiàn)，此外本研究發(fā)現(xiàn)VAP32可減少Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生，提高細(xì)胞內(nèi)SOD酶的活性。原因可能是AD早期神經(jīng)元斑塊在形成時(shí)，穩(wěn)定性較差，容易被水解，刺激神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激。研究證實(shí)，AD患者的大腦中會(huì)存在大量磷酸化的JNK，JNK被證實(shí)與APP的磷酸化有關(guān)，參與水解淀粉樣蛋白Aβ通路〔18〕。另一方面，JNK可調(diào)節(jié)BACE1的表達(dá)水平，持續(xù)產(chǎn)生Aβ，從而促進(jìn)淀粉樣斑塊持續(xù)的形成，而這一過(guò)程對(duì)AD患者來(lái)說(shuō)無(wú)疑是致命的〔19〕。報(bào)道顯示，AD在 BACE1蛋白表達(dá)升高的同時(shí)，常會(huì)伴隨ADAM10蛋白表達(dá)水平降低〔20〕，由于BACE1與ADAM10蛋白會(huì)存在對(duì)共同底物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合關(guān)系，BACE1的表達(dá)降低，會(huì)通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制反過(guò)來(lái)刺激ADAM10的表達(dá)，所以一旦JNK通路的激活被抑制，BACE1蛋白的表達(dá)會(huì)降低，而ADAM10蛋白的升高會(huì)同時(shí)被發(fā)現(xiàn)〔21〕。