穆燕 律鳳霞 艾鑫 趙文君

摘 要：分離純化野生蜜環(huán)菌菌絲培養(yǎng)物，研究菌絲體代謝物質(zhì)對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌的抑制作用.采集野生蜜環(huán)菌子實(shí)體，獲得遺傳同一性菌絲體純培養(yǎng)物，振蕩培養(yǎng)獲得菌絲體代謝液，觀察其對(duì)致病菌的抑菌效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離純化得到的菌絲體純培養(yǎng)物與蜜環(huán)菌遺傳同一，菌絲體代謝液對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌等食品中常見的致病菌具有較好的抑制作用

關(guān)鍵詞：蜜環(huán)菌;組織分離;分子鑒定;致病菌

[中圖分類號(hào)]180.6140 ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

隨著人們對(duì)食品安全的高度重視，天然食品防腐劑的價(jià)值被越來(lái)越多的人認(rèn)可和重視.許多食藥用菌具有天然的抑菌效果[1-3]，既能提供食藥用成份，也可替代化學(xué)防腐劑，保證食品純天然質(zhì)量.蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）俗稱榛蘑，屬白蘑科蜜環(huán)菌屬的一種好氧性兼性寄生真菌[4]，廣泛分布于世界各地，在我國(guó)的黑龍江、吉林、青海、浙江、湖南、貴州等省常見.[5]本實(shí)驗(yàn)研究蜜環(huán)菌代謝物質(zhì)對(duì)食品中常見致病菌的抑制作用，探討蜜環(huán)菌菌絲體在食品中的食藥用價(jià)值.

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)材料 9月末10月初野外采集蜜環(huán)菌子實(shí)體.采集到的蜜環(huán)菌子實(shí)體棕黃色或淺土黃色，中央部顏色稍深，菌蓋表面密生小鱗片或叢卷毛狀鱗片，開傘的菌蓋邊緣多波浪形，內(nèi)部具有放射狀條紋，菌柄長(zhǎng)柱形稍彎曲，纖維質(zhì)，內(nèi)部松軟，符合蜜環(huán)菌子實(shí)體表型特征.

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella Castellani）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）由牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

實(shí)驗(yàn)儀器 PCR試劑盒（寶生物工程有限公司產(chǎn)品），真菌DNA提取試劑盒（QIAGEN公司產(chǎn)品），雙面超凈工作臺(tái)，恒溫光照培養(yǎng)箱，全自動(dòng)高溫蒸汽滅菌鍋，PCR儀，恒溫水浴鍋.

1.2 培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基 20%馬鈴薯，2%葡萄糖，1%酵母浸粉，1%瓊脂粉，0.3%磷酸二氫鉀，0.15%硫酸鎂，0.01%維生素B1.

液體培養(yǎng)基配方 20%馬鈴薯、2%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.3%磷酸二氫鉀、0.15%硫酸鎂、0.01%維生素B1.

2 試驗(yàn)方法

2.1 野生蜜環(huán)菌子實(shí)體組織分離

組織分離法分離菌絲體.在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精消毒蜜環(huán)菌子實(shí)體表面，掰開蘑菇傘頂組織，無(wú)菌解剖刀割取內(nèi)部小塊菌肉，接種于平板PDA加富培養(yǎng)基中.重復(fù)接種三板，23 ℃恒溫暗培養(yǎng).觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，保證菌落單一，無(wú)污染.

2.2 蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)

選擇組織分離后單一無(wú)污染的菌落，無(wú)菌環(huán)境下挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，23℃恒溫振蕩培養(yǎng)15 d.

2.3 蜜環(huán)菌子實(shí)體及菌絲體DNA分子鑒定[6]

純培養(yǎng)物液體振蕩再培養(yǎng)，過(guò)濾獲得蜜環(huán)菌菌絲體球，用真菌DNA提取試劑盒分別提取子實(shí)體和菌絲體DNA，以真菌ITS通識(shí)引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表1.

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗(yàn)證，子實(shí)體DNA和菌絲體DNA的PCR產(chǎn)物各選兩個(gè)特異條帶清晰的送生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)，確定分離得到的菌絲體和子實(shí)體之間的遺傳同一性.

2.4 蜜環(huán)菌代謝液抑菌實(shí)驗(yàn)

致病菌活化 取出低溫保存的致病菌大腸桿菌、志賀氏菌、金黃葡萄球菌和副溶血性弧菌，無(wú)菌環(huán)境下分別轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，得到致病菌菌懸液.

蜜環(huán)菌代謝液制備 振蕩培養(yǎng)15 d的蜜環(huán)菌培養(yǎng)液，無(wú)菌條件下過(guò)濾得濾液，加10%的1×PBC緩沖液.

牛津杯法[7]驗(yàn)證抑菌效果 超凈工作臺(tái)內(nèi)將融化的LB固體培養(yǎng)基10～15 mL倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，放置凝固作為底層.將活化后的4種致病菌菌懸液與40 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基按1∶2的比例混合，分別倒入已凝固的LB固體培養(yǎng)基平皿上，倒入量約10～15 mL，在混合培養(yǎng)基凝固前迅速均勻擺放4個(gè)無(wú)菌牛津杯.待培養(yǎng)基凝固后在每個(gè)牛津杯中注滿蜜環(huán)菌代謝液，移到37 ℃恒溫環(huán)境靜置培養(yǎng)16～20 h后，觀察抑菌效果，測(cè)量抑菌圈直徑.

3 結(jié)果與分析

3.1 蜜環(huán)菌組織分離培養(yǎng)

組織分離法培養(yǎng)的菌絲體表現(xiàn)為白色致密菌絲，培養(yǎng)后期菌落內(nèi)部有菌索形成（圖1）.

3.2 蜜環(huán)菌分離菌液體培養(yǎng)

蜜環(huán)菌純化菌恒溫振蕩液體培養(yǎng)15 d后得到大小均勻的白色菌球，代謝液清澈，菌球清晰可見，無(wú)菌條件過(guò)濾得清澈濾液.

3.3 蜜環(huán)菌子實(shí)體及菌絲體DNA分子鑒定

過(guò)濾得到的菌球與子實(shí)體同時(shí)提取DNA，以真菌ITS通識(shí)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離（圖2）.

依DNA 2 000 bp maker可見：2個(gè)子實(shí)體DNA和5個(gè)菌絲體DNA的PCR產(chǎn)物均在大于750 bp處出現(xiàn)特異條帶，菌絲體PCR產(chǎn)物比子實(shí)體PCR產(chǎn)物條帶清晰且亮度高.測(cè)序結(jié)果表明：

子實(shí)體DNA和菌絲體DNA序列相同.測(cè)序序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Nucleotide BLAST比對(duì)，與網(wǎng)站公布MW418 555.1同源性達(dá)100%，確定采集的子實(shí)體和分離的純培養(yǎng)物為東北蜜環(huán)菌.

3.4 蜜環(huán)菌代謝液抑菌效果

蜜環(huán)菌代謝液對(duì)4種致病菌的抑菌效果見圖3.四組試驗(yàn)培養(yǎng)基中牛津杯周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，不同致病菌中的抑菌圈大小和透明度有明顯差異.對(duì)大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)為抑菌圈直徑大且透明度高，對(duì)金黃葡萄球菌和志賀氏菌的抑制效果為抑菌圈直徑大但透明度不高，對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果為抑菌圈直徑較小但透明度高.

4 結(jié)論

蜜環(huán)菌代謝液對(duì)食品中常見大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌等食品中常見致病菌具有較好的抑菌效果，蜜環(huán)菌代謝液對(duì)不同致病菌抑菌效果的差異可通過(guò)提高添加深度和純度進(jìn)一步進(jìn)行研究.蜜環(huán)菌生長(zhǎng)不需要苛刻的培養(yǎng)條件，組織培養(yǎng)容易獲得大量菌鎖及菌絲體，液體培養(yǎng)容易獲得大量菌球及代謝液，可彌補(bǔ)子實(shí)體季節(jié)性生長(zhǎng)的限制.

參考文獻(xiàn)

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[2]倪錦虹，彭亮聰.食用菌提取物的抑菌作用研究進(jìn)展[J].食品安全導(dǎo)刊.2021（09）：150-151.

[3]羅青，王國(guó)霞.藥食用真菌抑菌作用的研究進(jìn)展[J].鄭州師范教育，2018，04（3）：30-32.

[4]袁媛，劉景圣.蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009（7）：57-59.

[5]聶維.黑龍江榛蘑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及生長(zhǎng)環(huán)境調(diào)查探究[J].種子科技，2021，05（3）：110-112.

[6]趙世明，律鳳霞.番茄早疫病病原菌分離純化及分子鑒定[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào);自然科學(xué)版，2020（04）：31-34.

[7]熊莉，朱謙慧.在本科微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中拓展抑菌實(shí)驗(yàn)的探索[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2020，04（09）：88-92.

編輯：琳莉