陳本禎，江利華，李惠玲，張明強(qiáng)

(1.四川省婦幼保健院麻醉科，四川 成都610045；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院手術(shù)室，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，四川 成都610072)

七氟烷在小兒麻醉與鎮(zhèn)靜中的應(yīng)用非常廣泛，在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)報(bào)道了新生期七氟烷麻醉或暴露導(dǎo)致的神經(jīng)認(rèn)知障礙。然而,由于人體在不同的生長(zhǎng)階段有許多復(fù)雜的環(huán)境應(yīng)激因素，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是否可以直接轉(zhuǎn)化為人類還有待研究[1～3]。對(duì)應(yīng)激因素的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)失調(diào)與廣泛的壓力相關(guān)的神經(jīng)精神后遺癥有關(guān),包括抑郁、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)[4～6]。越來越多的研究表明,新生兒麻醉可能導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)，并在以后的生活中應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[7,8]。嚙齒類動(dòng)物新生期麻醉暴露后的應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)可能會(huì)加劇神經(jīng)發(fā)育異常[9]。神經(jīng)認(rèn)知異常是由新生兒麻醉暴露的累積影響的結(jié)果,后來被疾病和/或各種心理社會(huì)壓力等不良應(yīng)激因素所放大。據(jù)報(bào)道，嚙齒類動(dòng)物在新生兒時(shí)期(出生后7天內(nèi))接受七氟烷暴露會(huì)導(dǎo)致類似自閉癥譜系障礙(autistic spectrum disorder,ASD)的異常社會(huì)行為。ASD癥候?qū)W的某些特征可能會(huì)使該群體更容易發(fā)生創(chuàng)傷暴露和PTSD的風(fēng)險(xiǎn)[10,11]。本研究采用經(jīng)足電休克PTSD模型，探討新生大鼠反復(fù)接觸七氟烷是否增加應(yīng)激暴露的風(fēng)險(xiǎn)，并加重青春期(生后33～46天)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的發(fā)生，以及研究新生兒大腦去極化γ-氨基丁酸A型受體(GABAAR)活動(dòng)是否參與了這些異常的調(diào)節(jié)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究時(shí)間為2021年3～7月，36只SD孕大鼠購(gòu)自成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)在(24±1)℃的條件下，采用12 h 晝夜節(jié)律控制(光照從07∶00～19∶00)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均可自由進(jìn)食和飲水。該研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1分組方法 實(shí)驗(yàn)分為三組，新生期SD雄性大鼠隨機(jī)分為七氟烷暴露組(SEV組)、七氟烷暴露+布美他尼預(yù)處理組(SEV+BUM組)及對(duì)照組，每組各12只。SEV組和SEV+BUM組大鼠在出生后第5、6、7天連續(xù)行2.1%七氟烷暴露2小時(shí)/天，建立新生大鼠七氟烷暴露模型。SEV+BUM組大鼠在每天七氟烷暴露前15 min給予腹腔注射布美他尼 1.82 mg/kg。SEV組大鼠在每日暴露前15 min給予等容積的生理鹽水腹腔注射。對(duì)照組大鼠在出生后24、25和26天(青少年期)連續(xù)行七氟烷暴露2小時(shí)/天，建立七氟烷暴露模型。

1.2.2七氟烷暴露模型建立方法 將大鼠置于透明的呼吸環(huán)路暴露箱(5L)中，箱內(nèi)裝有干燥劑和二氧化碳吸附劑，并已提前調(diào)節(jié)好箱內(nèi)七氟烷氣體濃度。持續(xù)給予2.1%七氟烷+100% O2(2 L/min)(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20070172，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)，觀察實(shí)驗(yàn)鼠體位，呼吸及膚色，避免壓迫，窒息等意外情況。暴露維持過程中，麻醉箱內(nèi)氣體濃度由持續(xù)監(jiān)測(cè)多參數(shù)麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀(Vamos ARTJ-0062，德爾格醫(yī)療設(shè)備上海有限公司)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。暴露結(jié)束后，待實(shí)驗(yàn)鼠清醒30 min后放回籠中。SEV組和SEV+NUM組大鼠接受最后一次七氟烷暴露后，各取一批次(4只)大鼠立即通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)分析大腦前額葉皮質(zhì)中NKCC1和KCC2的mRNA水平，并與對(duì)照組同期大鼠(4只)對(duì)照。

1.2.3建立經(jīng)足電休克PTSD模型 各組其余批次大鼠在生后第31～34天(青春期)建立經(jīng)足電休克PTSD模型，方法如下：自制條件恐懼箱，箱壁由透明有機(jī)玻璃組成，規(guī)格為36 cm×23 cm×48 cm。底部由 20根銅條組成，可以通電流，銅條直徑約 0.5 cm，相鄰兩根銅條之間相隔1 cm。箱頂壁安裝有揚(yáng)聲器，可以產(chǎn)生 4.5 kHz，60 dB的聲音。將實(shí)驗(yàn)大鼠放入條件恐懼箱中，適應(yīng)5 min，然后給予聲音信號(hào)(4.5 kHz，60 dB，30 s)連續(xù)呈現(xiàn) 10 次，兩次聲音間隔時(shí)間為2 min，在第5次聲音時(shí)與不可逃避的足底電擊(1.2 mA，5 s)配對(duì)呈現(xiàn)，共6次。最后一次配對(duì)呈現(xiàn)后，大鼠在實(shí)驗(yàn)箱停留2 min，隨后取出，送回動(dòng)物房日常飼養(yǎng)。連續(xù)三天。大鼠出現(xiàn)僵立行為(只有呼吸、四肢僵立)即為條件恐懼性創(chuàng)傷應(yīng)激模型建立。箱子在每次使用后均清洗干凈，并用75%的酒精擦洗箱底。在條件反射試驗(yàn)兩天后，對(duì)同一組大鼠進(jìn)行消退訓(xùn)練，在具有不同視覺和觸覺線索的環(huán)境中，經(jīng)過兩分鐘的適應(yīng)期后，接受6 × 2分鐘的條件性刺激(CS)呈現(xiàn)(間隔2分鐘)。記錄每2分鐘CS呈現(xiàn)時(shí)發(fā)生僵直反應(yīng)的大鼠的比率(僵直反應(yīng)的定義為除呼吸外的運(yùn)動(dòng)消失，呈木僵狀態(tài)，僵直占比的計(jì)算方法為發(fā)生僵直反應(yīng)的次數(shù)/CS呈現(xiàn)的次數(shù))以測(cè)量恐懼記憶。每組各取一批次檢測(cè)P31大鼠在條件恐懼作用前30 min和最后一次非條件刺激后5 min (after-us)的血清皮質(zhì)酮水平。P33大鼠恐懼消退訓(xùn)練5 min后，測(cè)定血清皮質(zhì)酮水平。血清皮質(zhì)酮通過采用ELISA試劑盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI)測(cè)定。

1.2.4高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 各組余下的大鼠(每組各4只)在P35進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)其焦慮水平。迷宮由兩個(gè)長(zhǎng)、寬分別為30 cm×5 cm的開臂、兩個(gè)長(zhǎng)、寬、高分別為30 cm×5 cm×15 cm的閉臂組成，二者交接處是一個(gè)連接四只臂的中央平臺(tái)(5 cm×5 cm)。該迷宮由1 cm厚的木板制成，四臂及中央平臺(tái)均為黑色，整體固定于可升降的不銹鋼支架上，迷宮底座調(diào)節(jié)距地面40 cm處。實(shí)驗(yàn)開始將大鼠置于迷宮中央頭朝向開臂，通過攝像監(jiān)視器垂直監(jiān)視記錄其活動(dòng)情況，通過對(duì)比大鼠在開臂和閉臂內(nèi)的滯留時(shí)間和路程來評(píng)價(jià)大鼠的焦慮水平。開臂停留時(shí)間百分比=開臂滯留時(shí)間/(開臂滯留時(shí)間+閉臂滯留時(shí)間)。每只大鼠測(cè)試5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均用95%酒精濕布擦拭迷宮，繼用干布擦凈后再進(jìn)行下一輪測(cè)試，以減少相互干擾。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析(兩兩比較采用Bonferroni 法)、雙因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1/KCC2 mRNA 表達(dá)水平比較SEV+BUM組大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，低于SEV組(P<0.05)；SEV組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)中NKCC1 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。 SEV組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)中KCC2 mRNA 的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SEV組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1/KCC2 mRNA 表達(dá)比率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，SEV+BUM組大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1/KCC2 mRNA 表達(dá)比率顯著低于SEV組(P<0.05)。見表1。

表1 三組大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1/KCC2 mRNA 表達(dá)水平比較

2.2 三組血清皮質(zhì)酮分泌水平及焦慮水平比較SEV組大鼠基礎(chǔ)血清皮質(zhì)酮分泌水平以及第35天高架十字迷宮測(cè)試時(shí)的開臂滯留時(shí)間百分比和對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SEV組大鼠在新生期重復(fù)接受七氟烷暴露，在青春期建立PTSD模型后血清皮質(zhì)酮的分泌較對(duì)照組同期明顯增加 (P<0.01)，高架十字迷宮測(cè)試中的焦慮水平明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 三組血清皮質(zhì)酮分泌水平及焦慮水平比較

2.3 三組恐懼消退和和重現(xiàn)測(cè)試比較SEV組大鼠在新生期接受重復(fù)七氟烷暴露后PTSD模型中的恐懼消退與復(fù)現(xiàn)測(cè)試中僵直占比明顯高于對(duì)照組，SEV+BUM組大鼠PTSD模型中的恐懼消退和復(fù)現(xiàn)測(cè)試中僵直占比與對(duì)照組沒有差異。SEV+BUM組大鼠在恐懼消退與復(fù)現(xiàn)測(cè)試中的僵直占比明顯少于SEV組(P=0.018)，見表3。

表3 三組僵直占比比較(%)

3 討論

本研究驗(yàn)證了新生期SD大鼠反復(fù)接觸2.1%濃度七氟烷增加了應(yīng)激暴露的風(fēng)險(xiǎn)，并加劇青春期PTSD的發(fā)展，同時(shí)還研究了新生兒大腦去極化GABAAR活動(dòng)是否參與了這些異常的調(diào)節(jié)。七氟烷在小兒的最低有效肺泡濃度(MAC值)約為2.1%，我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用該濃度類比七氟烷在臨床麻醉與鎮(zhèn)靜實(shí)踐中的常用劑量。本研究結(jié)果顯示SD大鼠在新生期重復(fù)接受七氟烷暴露增強(qiáng)大腦GABAAR去極化活動(dòng)并顯著增加大腦前額葉皮質(zhì)NKCC1 / KCC2 mRNA表達(dá)比率。SD大鼠新生期接受過重復(fù)七氟烷暴露并不影響其幼年期血清皮質(zhì)酮基礎(chǔ)分泌水平以及高架十字迷宮測(cè)試時(shí)的焦慮水平。但是，本研究通過幼年期SD大鼠經(jīng)足電休克PTSD模型研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在新生期而不是幼年期，重復(fù)七氟烷暴露增加在PTSD模型中的血清皮質(zhì)酮的分泌，加劇了恐懼消退訓(xùn)練和回憶的缺陷，進(jìn)而增加了高架十字迷宮測(cè)試時(shí)的焦慮水平。在七氟烷暴露前給予NKCC1抑制劑布美他尼預(yù)處理，可顯著減輕這些反應(yīng)。本研究表明，大鼠新生期反復(fù)接受七氟烷暴露加重其幼年期PTSD的發(fā)生與發(fā)展，其機(jī)制可能與新生兒大腦GABAAR去極化活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)。

NKCC1/KCC2平衡失調(diào)與腦回路的過度興奮有關(guān)，并導(dǎo)致廣泛的應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙[12，13]。NKCC1在嚙齒動(dòng)物中的峰值表達(dá)大約在生后5～7天，這構(gòu)成了未成熟神經(jīng)元中GABAAR介導(dǎo)的去極化反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。有研究報(bào)道，NKCC1在維持大腦GABA能傳遞功能和調(diào)節(jié)母嬰分離導(dǎo)致的成年后生活應(yīng)激易感性中發(fā)揮重要作用[14]。由于GABA受體介導(dǎo)的對(duì)LHPA軸活動(dòng)的抑制是成熟大腦適應(yīng)應(yīng)激的重要機(jī)制[15]，成熟大腦基于GABAAR的應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制可能導(dǎo)致新生兒大腦的相反的應(yīng)激惡化效應(yīng)。在本研究中，大鼠前額葉皮質(zhì)中NKCC1/KCC2 mRNA比值在生后第7天接受完最后一次七氟烷暴露后立即增加，大鼠在幼年期PTSD模型中表現(xiàn)出的應(yīng)激易感性也顯著增加，在新生兒每次七氟烷暴露之前給予NKCC1抑制劑布美他尼預(yù)處理可顯著緩解這種反應(yīng)。

PTSD的焦慮特征是抑制恐懼的能力不足。恐懼消退可能涉及大腦前額葉皮質(zhì)與海馬、丘腦和新皮層通路的相互作用。本研究在PTSD模型的研究中發(fā)現(xiàn)，新生大鼠反復(fù)七氟烷暴露，可增加血清皮質(zhì)酮的分泌，加重恐懼消退訓(xùn)練和回憶的缺陷，進(jìn)而增加了高架十字迷宮測(cè)試時(shí)的焦慮水平。GABAAR是成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性受體，但在神經(jīng)發(fā)育早期至出生后早期階段卻作為興奮性受體發(fā)揮作用[16]，在新生兒期反復(fù)七氟烷暴露增加了電腦GABAAR介導(dǎo)的去極化，這個(gè)時(shí)期過度的去極化會(huì)導(dǎo)致類似ASD的社交障礙。ASD患者可能存在PTSD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究結(jié)果為麻醉相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的治療提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。更重要的是，未來的研究應(yīng)仔細(xì)探索生活中應(yīng)激因素與七氟烷誘發(fā)的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙之間的病因關(guān)系。