朱杰

摘要：背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞移植及組織工程研究中常用的細(xì)胞，近來有關(guān)于其標(biāo)記示蹤技術(shù)的研究日益增多，研究的進(jìn)展有目共睹但就其示蹤方法的選擇上仍存在較大爭議。目的：對國內(nèi)外 BMMSC的標(biāo)記示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。方法：本文以“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、標(biāo)記方法、示蹤技術(shù)”等中文關(guān)鍵詞在萬方數(shù)據(jù)庫和CNKI進(jìn)行檢索，并以“l(fā)abeling，bone? marrow mesenchymal stem cell，Tracer”等英文關(guān)鍵詞在 PubMed、Web of Science 數(shù)據(jù)庫檢索，選擇文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。結(jié)果和結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有眾多標(biāo)記方法及示蹤技術(shù)，主要有熒光染料標(biāo)記法、熒光蛋白標(biāo)記法、核苷酸標(biāo)記法、核磁共振對比增強(qiáng)標(biāo)記法等。不同的示蹤方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，科研實(shí)驗(yàn)所選擇的示蹤方法應(yīng)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、標(biāo)記步驟簡便、檢測方法簡單、對細(xì)胞或生物影響小等優(yōu)點(diǎn)，而科研工作者也在不斷改進(jìn)更新示蹤方法，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的示蹤技術(shù)仍有待于進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;標(biāo)記方法;示蹤技術(shù);綜述

【中圖分類號(hào)】 G644.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）10--02

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有較強(qiáng)自我更新能力的多能干細(xì)胞，具有培養(yǎng)方便，提取簡單，分化潛能高，免疫原性低1等優(yōu)點(diǎn)故被廣泛應(yīng)用于組織工程，研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入宿主體內(nèi)可提高宿主缺失功能的再生修復(fù)程度2，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究日益增多，各類標(biāo)記示蹤技術(shù)層出不窮，尋找一種標(biāo)記穩(wěn)定且不影響細(xì)胞理化性質(zhì)的標(biāo)記方法能有效監(jiān)測干細(xì)胞移植后的增殖分化情況。本文對幾類常見的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)作一綜述。

1.熒光染料標(biāo)記法

1.1 CM-DiL

DiL是一種可結(jié)合于細(xì)胞膜并在膜內(nèi)通過被動(dòng)擴(kuò)散而標(biāo)記細(xì)胞的親脂性熒光染料，它還可以通過細(xì)胞的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞來標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。其在細(xì)胞內(nèi)消失周期較長，且較難由標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非標(biāo)記細(xì)胞，細(xì)胞毒性低，對細(xì)胞活力及細(xì)胞生長影響較小3。 CM-Dil（氯苯甲酰氨-1，1’雙十八烷基-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽，Chloromethylbenzamido-1， 1-Dioctadecyl-3，3，3，3-TetramethylindocarbocyaninePerchlorate）是在Dil中加入了氯甲基取代物而成的Dil的衍生物，其通過與細(xì)胞內(nèi)含巰基的多肽和蛋白結(jié)合而獲得能夠抵抗醛類的固定作用的能力，近年來已基本替代 Dil在細(xì)胞示蹤方面的使用。CM-DIL是一種無毒的親脂性膜染料，其染色穩(wěn)定性和染色強(qiáng)度優(yōu)于大多數(shù)其他熒光染料或放射性同位素4。其熒光激發(fā)波和發(fā)射波長分別為 553 nm、570 nm5。研究表明該染料標(biāo)記能力強(qiáng)，且不影響間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外的遷移或多向分化潛能6，陳7等人的研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)CM-Dil染色后傳至第8代時(shí)仍有較強(qiáng)的熒光表達(dá)。CM-Dil不適用于細(xì)胞長期示蹤是由于其標(biāo)記細(xì)胞膜，有隨著細(xì)胞分裂熒光強(qiáng)度也會(huì)逐漸降低的缺點(diǎn)。

1.2 CF-SE

羧基熒光素乙酰乙酸5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE）是一種非極性分子，具有很高的膜通透性而無熒光活性，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境后，其乙酸基團(tuán)被細(xì)胞內(nèi)的酶水解而轉(zhuǎn)化為氨基反應(yīng)性羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），后者帶負(fù)電荷并具有很高的熒光活性，且細(xì)胞膜不再對其通透，其含有的succinimidyl ester基團(tuán)能與細(xì)胞中的游離胺基結(jié)合形成穩(wěn)定的具有綠色熒光的復(fù)合物存在于細(xì)胞中8，9。CFSE標(biāo)記活細(xì)胞后可在細(xì)胞傳代時(shí)將熒光標(biāo)記物均勻地分配到子代細(xì)胞中，故分裂后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞一半，以此可用流式細(xì)胞儀在 488nm波長處進(jìn)行分析，以此來推斷細(xì)胞的傳代情況。研究表明CFSE染色不影響角質(zhì)形成細(xì)胞或黑素細(xì)胞的活性或正常遷移功能10。隨著細(xì)胞的分裂增殖過程不斷進(jìn)行，細(xì)胞熒光染色活性也會(huì)隨著細(xì)胞的分裂逐漸遞減，故CFSE熒光染色法一般不用于細(xì)胞長期示蹤。

1.3 DAPI

DAPI即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4’，6-diamidino-2-phenylindole）是較為常用的細(xì)胞核熒光染料，其能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中并結(jié)合在DNA雙螺旋上，故常用來標(biāo)記活細(xì)胞。DAPI標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記效率高，毒性小，費(fèi)用低。缺點(diǎn)是由于DAPI是與DNA結(jié)合，DNA半保留復(fù)制的特點(diǎn)會(huì)使DAPI在子代細(xì)胞中的含量越來越低，此外，有研究表明死亡后的標(biāo)記細(xì)胞釋放出的DAPI可能被周圍細(xì)胞攝取而出現(xiàn)假陽性11。Shang12等人的研究顯示DAPI標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后在紫外熒光激發(fā)下，標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈暗區(qū)，標(biāo)記后的第3代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯減弱且標(biāo)記細(xì)胞存在活力逐漸降低的趨勢。因此DAPI也適用于細(xì)胞的短期示蹤。

2.分子學(xué)標(biāo)記法

2.1熒光蛋白標(biāo)記法

熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是近來發(fā)展迅速的示蹤技術(shù)，熒光蛋白即可自行發(fā)出不同顏色熒光的蛋白質(zhì)，其中應(yīng)用價(jià)值最大的是由 Shimomura13等在 1962年由維多利亞多管水母中提取而來的綠色熒光蛋白。GFP生色團(tuán)結(jié)構(gòu)被高能量光子照射后發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，由高能級(jí)構(gòu)象躍遷為低能級(jí)構(gòu)象后發(fā)出能量較低的光子14從而發(fā)出綠色熒光 ，GFP有著易于檢測、靈敏度高、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、無毒等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為被廣泛應(yīng)用的示蹤物質(zhì)。但是天然GFP熒光強(qiáng)度較低，故其通過氨基酸替換形成的突變體：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）成為目前主要使用的熒光蛋白，該突變保留了GFP的諸多優(yōu)點(diǎn)，使其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)且更易于表達(dá)。Pinero 等用EGFP標(biāo)記了BMSC后熒光穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)超過了60天。熒光蛋白標(biāo)記的穩(wěn)定高效使其被廣泛應(yīng)用于生物的研究中，但熒光蛋白標(biāo)記法存在著費(fèi)用高以及研究周期長的缺點(diǎn)。由于其熒光表達(dá)穩(wěn)定且持續(xù)時(shí)間長，故更適用于一些長研究周期的示蹤研究。

2.2核苷酸標(biāo)記法

細(xì)胞增殖周期一共包括4個(gè)時(shí)期，DNA是細(xì)胞在S期利用各種原料以半保留復(fù)制的形式進(jìn)行合成的，BrdU即5-溴脫氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）結(jié)構(gòu)類似于胸腺嘧啶核苷酸，當(dāng)細(xì)胞周期處于S期時(shí)且有BrdU存在于細(xì)胞中時(shí)，BrdU可競爭內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)從而進(jìn)入細(xì)胞的核酸中，后通過抗BrdU單克隆抗體對其進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色便可觀察其標(biāo)記細(xì)胞的情況?？笲rdU單克隆抗體不與細(xì)胞自身的胸腺嘧啶發(fā)生反應(yīng)，避免了假陽性的情況出現(xiàn)。許偉等人的研究使用BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示BrdU標(biāo)記率為86.2%。BrdU標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)有：操作簡便、標(biāo)記迅速、標(biāo)記率高。但有報(bào)道稱未被標(biāo)記細(xì)胞可吞噬死亡細(xì)胞所釋放的BrdU從而出現(xiàn)假陽性標(biāo)記。5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（EdU）是另一種胸腺嘧啶核苷類似物，但由于其損害細(xì)胞表型并降低細(xì)胞活力，故很少應(yīng)用于干細(xì)胞示蹤。

3.核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）對比增強(qiáng)劑標(biāo)記法

1999年Weissleder提出分子影像學(xué)概念，分子影像學(xué)是通過不同的影像學(xué)技術(shù)顯示不同分子水平下的特定分子，反映活體分子水平變化，在影像學(xué)方向研究其生物學(xué)行為的科學(xué)。主要包括磁共振成像、核醫(yī)學(xué)成像和計(jì)算機(jī)斷層成像等技術(shù)。由于核磁共振具有較高的時(shí)間和空間分辨率，加之近年來核磁共振對比劑研究的不斷深入，故目前核磁共振對比增強(qiáng)劑標(biāo)記法在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞示蹤研究中應(yīng)用較廣泛。該技術(shù)是用MRI追蹤事先在體外被磁共振增強(qiáng)劑標(biāo)記后并移植的細(xì)胞，目前應(yīng)用較多的磁共振對比增強(qiáng)劑是超順磁性氧化鐵，起初其被用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞，主要用于一些有關(guān)免疫研究的示蹤，現(xiàn)隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞示蹤中。SIPO具有超順磁性、良好的生物相容性及穩(wěn)定性，但直接標(biāo)記干細(xì)胞時(shí)標(biāo)記率低，因此需通過轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)來提高標(biāo)記率。周26等人應(yīng)用多聚賴氨酸作為轉(zhuǎn)染劑。其表面帶大量正電荷，表面帶負(fù)電荷的氧化鐵微粒通過靜電作用可與之充分結(jié)合而提高干細(xì)胞的磁標(biāo)記率。Mishra的研究發(fā)現(xiàn)，PLL與SPIO聯(lián)合標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，可顯著提高后者的橫向弛豫率。SPIO標(biāo)記細(xì)胞也有顯著缺點(diǎn)：1.隨著細(xì)胞分裂導(dǎo)致子代細(xì)胞內(nèi)SPIO含量降低，進(jìn)而影響觀察效果。2.細(xì)胞死亡后SPIO又有被周圍未被標(biāo)記的細(xì)胞吞噬而產(chǎn)生假陽性的可能。3.高劑量SPIO標(biāo)記細(xì)胞時(shí)會(huì)降低細(xì)胞活性。

結(jié)論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能高，增殖能力強(qiáng)，目前被當(dāng)作種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)及基因治療中。其標(biāo)記示蹤技術(shù)眾多且均具有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，所選用的標(biāo)記方法應(yīng)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、對細(xì)胞或生物影響小等優(yōu)點(diǎn)。而科技工作者也在不斷改進(jìn)更新示蹤方法，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的示蹤技術(shù)仍有待于進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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