文火月，林偉雄，肖 璇，陳 萍△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科；2.國家衛(wèi)生健康委地中海貧血防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院地中海貧血防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.廣西醫(yī)科大學(xué)地中海貧血防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

β-地中海貧血是一種由β-珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致β-珠蛋白合成障礙的單基因遺傳病，在我國南方地區(qū)具有較高的基因攜帶率，其中尤以兩廣地區(qū)為重[1]。通常情況下，單個β-珠蛋白等位基因突變即突變的雜合子不會出現(xiàn)臨床癥狀，突變的純合子或雙重雜合子才會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀[2]。血液學(xué)檢查和血紅蛋白分析是識別地中海貧血攜帶者的基礎(chǔ)，分子診斷對于明確地中海貧血診斷和預(yù)測疾病的嚴(yán)重程度起到重要的作用，對實(shí)施地中海貧血的治療和預(yù)防具有重要意義[3]。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的β-珠蛋白基因突變類型有400多種，而外顯子3區(qū)域的突變較少[4]。本研究報道1 例罕見的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG，HBB：c.344T＞C）突變導(dǎo)致β-地中海貧血的血液學(xué)特點(diǎn)和臨床特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2021年1～12月就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院并且地中海貧血篩查提示β-地中海貧血的病例共440例。

1.2 血常規(guī)檢查 用EDTA-K2抗凝采血管采集患者外周靜脈血，通過血細(xì)胞自動分析儀（CELLDYN1700，Abbott，美國）及配套試劑檢測患者的血紅蛋白含量（Hb）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血紅細(xì)胞（RBC）計數(shù)和紅細(xì)胞比容（HCT）等血常規(guī)檢測指標(biāo)。

1.3 血紅蛋白分析 應(yīng)用血紅蛋白分析儀（HbVaruantⅡ，Bio-Rad，美國）進(jìn)行Hb分析，檢測Hb組分如Hb A、Hb A2、Hb F和異常血紅蛋白。

1.4 DNA提取 采用Lad-Aid 820核酸提取儀及儀器配套核酸提取Midi 試劑提取血樣本的基因組DNA（廈門致善生物科技有限公司），用微量紫外分光光度計（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific，美國）檢測提取到的基因組DNA的濃度和純度。

1.5 β-地中海貧血基因突變分析

1.5.1 β-珠蛋白基因21 個位點(diǎn)的21 種突變類型定性檢測 采用基于熒光PCR 熔解曲線法的β-地中海貧血基因檢測試劑盒（廈門致善生物科技有限公司）檢測21 種β-地中海貧血突變（包括IVS-Ⅱ-654 M、-28 M、-29 M、14-15 M、15-16 M、17 M、41-42 M、26 M、27-28 M、30 M、37 M、43 M、71-72 M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、IVS-2 M M、-30 M、-31 M、-32 M、-73 M、-90 M）。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 β-珠蛋白基因測序 設(shè)計引物上游引物：5’-TACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG-3’，下游引物：5’-ATGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3’（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）。使用PCR擴(kuò)增儀（Gene-Amp9700，Thermo Fisher Scientific，美國）擴(kuò)增DNA樣本目的片段。PCR擴(kuò)增采用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司提供的TaKaRa LA Taq酶和2×GC Buffer。擴(kuò)增體系50 μL：含2×GC Buffer 25 μL，dNTP 8 μL，待測DNA樣本（100 ng/gL）3 μL，15 pmol/μL 的上游和下游引物各1 μL，LA Taq 酶0.3 μL，去離子水11.7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃60 s、58 ℃60 s、72 ℃120 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行β-珠蛋白基因測序。

1.6 α-地中海貧血基因分析

1.6.1 4種缺失型α-地中海貧血突變基因型檢測

采用基于Gap-PCR 方法的缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳市億立方生物技術(shù)有限公司），檢測α-地中海貧血4 種缺失型突變基因型：-α4.2，-α3.7，--SEA，--THAI。

1.6.2 3種非缺失型α-地中海貧血突變基因型檢測

采用基于熒光PCR 熔解曲線法的非缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒（廈門致善生物科技有限公司），檢測α-地中海貧血3種點(diǎn)突變基因型：Hb CS、Hb QS和Hb WS。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 440 例β-地中海貧血雜合子病例中，男性185 例，年齡范圍10 個月至83 歲，女性255例，年齡范圍7 個月至79 歲。從440 例β-地中海貧血病例中檢出1 例罕見的β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突變雜合子。該病例為女性，29 歲，面色較蒼白，皮膚鞏膜無黃疸，無出血點(diǎn)，無肝脾腫大，無輸血史，既往血清鐵蛋白檢查結(jié)果為429.87 ng/mL。

2.2 血常規(guī)結(jié)果 1例β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例的血常規(guī)結(jié)果：Hb 78.3 g/L，RBC 3.65×1012/L，MCV 66.52 fL，MCH 21.48 pg，MCHC 322.9 g/L及HCT 0.243。提示患者有中度貧血。其他439例單純β-地中海貧血雜合子的血常規(guī)結(jié)果：Hb（115.2±12.46）g/L，RBC（5.79±0.68）×1012/L，MCV（64.27±5.48）fL，MCH（20.10±1.94）pg，MCHC（312.58±8.41）g/L及HCT（0.37±0.03）。進(jìn)一步對439例β-地中海貧血雜合子病例中不同性別患者的血常規(guī)分析結(jié)果進(jìn)行比較，見表1。

表1 β-地中海貧血雜合子病例中不同性別患者血常規(guī)分析結(jié)果比較

2.3 血紅蛋白分析結(jié)果 β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例血紅蛋白分析結(jié)果：Hb A24.4%，Hb F 2.6%，未見異常血紅蛋白。

2.4 β-地中海貧血基因分析結(jié)果

2.4.1 β-地中海貧血突變基因型檢測 患者未檢測到21種β-地中海貧血突變基因型。

2.4.2 基因測序結(jié)果患者基因測序 結(jié)果表明，在β-珠蛋白基因第114 位密碼子處檢測到T＞C 雜合突變，即CTG＞CCG突變（圖1），根據(jù)人類基因組變異學(xué)會（HGVS）命名規(guī)則命名為HBB：c.344T＞C。

圖1 β-珠蛋白基因測序序列圖

2.5 α-地中海貧血基因檢測結(jié)果

2.5.1 缺失型α-地中海貧血試劑盒檢測 結(jié)果患者未檢出試劑盒范圍內(nèi)的4種缺失型α-地中海貧血基因型。

2.5.2 非缺失型α-地中海貧血試劑盒檢測 患者未檢出試劑盒范圍內(nèi)的3種非缺失型α-地中海貧血基因型。

3 討論

目前國內(nèi)外已報道β-珠蛋白基因突變類型有400多種（HbVar數(shù)據(jù)庫），國內(nèi)已報道β-珠蛋白基因點(diǎn)突變129種[5]，其中CD41-42、CD17、IVS-Ⅱ-654、-28、CD71-72、CD26、IVS-Ⅰ-1、-29 這8 種突變就占據(jù)了中國人群β-地中海貧血突變總體的絕大部分[6]。β-珠蛋白基因外顯子3區(qū)域突變相對較少，國內(nèi)外顯子3 區(qū)域突變報道罕見，已報道的如CD112（TGT＞TGA）（HBB:c.339T＞A）[7]和CD121（GAA＞TAA）（HBB:c.364G＞T）[8]基因突變，均為單個病例報道。

β-珠蛋白基因不同位點(diǎn)發(fā)生的突變對β-珠蛋白基因功能的影響不同。β-珠蛋白基因外顯子3區(qū)域?yàn)榛虻木幋a區(qū)，該區(qū)域的突變可能影響RNA 翻譯，從而干擾了β-珠蛋白基因的功能，合成異常的β-珠蛋白鏈。外顯子3的CD114（CTG＞CCG）突變使該位點(diǎn)編碼的亮氨酸被脯氨酸替換，該突變位于G-螺旋中，可能會對G-螺旋中用于血紅蛋白初始二聚體的形成和血紅蛋白四聚體的組裝的α1β1接觸點(diǎn)產(chǎn)生負(fù)面干擾。由此產(chǎn)生的未結(jié)合的異常β-珠蛋白鏈伴隨過剩的α-珠蛋白鏈沉淀于紅細(xì)胞內(nèi)，使紅細(xì)胞內(nèi)蛋白水解機(jī)制超載，造成無效的紅細(xì)胞生成，最終導(dǎo)致β-地中海貧血[9]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）雜合子突變最先于意大利人群中發(fā)現(xiàn)[10]，患者為1例14歲兒童，是該突變與（ααα/αα）三聯(lián)體形成的復(fù)合雜合子，中度貧血（Hb 75 g/L，MCV 71 fL，MCH 20.3 pg），Hb分析顯示：Hb A23.2%，Hb F 16%?；颊?歲左右開始出現(xiàn)貧血，最初分別在3歲和5歲時輸血1次，7歲以后每月輸血1次，表現(xiàn)為中間型β-地中海貧血。

其它文獻(xiàn)報道的CD114（CTG＞CCG）雜合子突變導(dǎo)致地中海貧血病例大部分為中度貧血，如見于愛爾蘭裔美國白人[11]、韓國[12]、日本[13]、智利的西班牙裔[14]的4例CD114（CTG＞CCG）雜合子突變病例，均為中度貧血（Hb 74～86 g/L），Hb 分析顯示Hb A2升高（3.3%～7.0%），1例病例Hb F為＜0.5%，其余病例Hb F為3.0%～7.5%。其中西班牙裔病例為1 例40 歲男性，從7 歲開始需要每6 周輸注兩個單位紅細(xì)胞以維持Hb水平在80～85 g/L，被診斷為中間型β-地中海貧血。Curur 等[15]報道的2 個俄羅斯家系6 例CD114（CTG＞CCG）雜合子病例，Hb 60～125 g/L，Hb 分析顯示Hb A24.0%～5.0%，Hb F 1.0%～14.7%。

CD114（CTG＞CCG）合并其它β-珠蛋白基因突變病例也有報道。Cannata 等[9]報道1 例CD114（CTG＞CCG）與IVS-Ⅰ-110（G＞A）的雙重雜合子，患者為10個月大的意大利女嬰，重度貧血（Hb 35 g/L，MCV 63.2 fL，MCH 19.6 pg），脾臟和肝臟腫大，表現(xiàn)為典型的重型β-地中海貧血。

至目前國內(nèi)未見CD 114（CTG＞CCG）突變病例報道。本研究在廣西人群中發(fā)現(xiàn)1 例CD114（CTG＞CCG）突變雜合子病例，患者血常規(guī)檢測顯示：RBC 3.65×1012/L，Hb 78.3 g/L，Hb 分析有Hb A2升高，為4.4%?；颊吲R床表現(xiàn)為中度貧血，無脾腫大和輸血史，未合并其它α-和β-地中海貧血基因突變。本病例與上述報道的大多數(shù)雜合子突變病例相似，有中度貧血，Hb A2升高。

單純β-珠蛋白基因突變雜合子病例臨床上一般無癥狀或有輕度貧血，通常表現(xiàn)為輕型β-地中海貧血[16]。本研究中除CD114（CTG＞CCG）突變雜合子病例外的439例β-地中海貧血雜合子病例表現(xiàn)為輕度貧血或無貧血。其中男性病例Hb、RBC 均值分別為122.06 g/L 和6.17×1012/L，較女性病例高，分析其原因，在正常生理情況下，男性的Hb、RBC 等的數(shù)值均高于女性。此外，439 例β-地中海貧血雜合子病例的MCV、MCH等均降低，這些改變符合β-地中海貧血的血液學(xué)特征。而男性病例MCV、MCH較女性病例低，造成這種差異的原因還需要更多病例做進(jìn)一步分析。

本文和國外報道的CD114（CTG＞CCG）雜合子病例表現(xiàn)為中度貧血。其可能機(jī)制為此突變可產(chǎn)生異常β-珠蛋白，異常β-珠蛋白伴隨過剩α-珠蛋白鏈的降解會給紅細(xì)胞前體的蛋白水解過程添加額外負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致更嚴(yán)重的無效紅細(xì)胞生成[12]，從而導(dǎo)致較嚴(yán)重的臨床表型。但因?yàn)椴±龜?shù)較少，仍需發(fā)現(xiàn)更多的病例做進(jìn)一步的研究，以便更全面了解該基因突變類型的血液學(xué)特點(diǎn)及臨床特征。

當(dāng)CD114（CTG＞CCG）合并β-珠蛋白基因IVS-Ⅰ-110（G＞A）突變時，由于IVS-Ⅰ-110（G＞A）突變可引起異常剪接mRNA的產(chǎn)生，兩種突變之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，從而引起更嚴(yán)重的β-地中海貧血表型[9]。當(dāng)CD114（CTG＞CCG）合并α-珠蛋白基因三聯(lián)體時，患者嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)可能與α-珠蛋白肽鏈產(chǎn)量增加進(jìn)一步加劇了α-珠蛋白肽鏈的過剩有關(guān)[16]。

β-珠蛋白基因CD114（CTG＞CCG）突變在國內(nèi)外都較為罕見，其雜合子在臨床上可表現(xiàn)為中度貧血，部分病例需要輸血等相應(yīng)治療。這些特征與其它大多數(shù)單純β-珠蛋白基因雜合子突變僅導(dǎo)致無癥狀或有輕度貧血不同[17]，值得我們重視，特別在臨床診療、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷中要加以注意，避免漏診和誤診，導(dǎo)致延誤治療。