韋 薇，張 秋，黃燕鳳，翟 露，劉玉花，馬 翠，黃 山，鐘 鑫，戴 霞△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，南寧 530007；4.北京醫(yī)院，北京 100730；5.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401320）

糖尿病與腸道菌群之間有著密切的聯(lián)系，腸道微生物環(huán)境穩(wěn)定依賴于益生菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，致病菌繁殖受到控制。但在糖尿病狀態(tài)下，腸道菌群處于中等失調(diào)的狀態(tài)，腸道內(nèi)的總菌數(shù)量下降，菌群的比例發(fā)生改變，厚壁菌門和變形菌門細菌的相對豐度升高，擬桿菌門和放線菌門細菌的相對豐度降低，糖尿病患者糞便中短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）濃度顯著降低[1-2]。厚壁菌門在促進機體對食物能量的攝取利用方面發(fā)揮了重要作用[3]。擬桿菌門參與發(fā)酵碳水化合物、多糖、膽汁酸和類固醇代謝，維持腸道正常生理等功能。放線菌中雙歧桿菌屬有酸化腸道內(nèi)環(huán)境、抑制腐敗菌和病原體生長等作用。變形菌門多數(shù)為致病菌，在腸道內(nèi)含量較少[4]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及功能受到多種因素的影響，其中運動與腸道菌群有著密切的聯(lián)系[5]。運動不僅能改善糖尿病患者的糖脂代謝，血壓、胰島素抵抗等代謝指標，還會影響人體腸道菌群的組成及代謝[6-7]。目前關(guān)于運動對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的研究多為有氧運動，抗阻運動及聯(lián)合有氧—抗阻運動的研究鮮有報道。據(jù)此，本研究對糖尿病小鼠進行8 周的有氧運動、抗阻運動及聯(lián)合有氧—抗阻運動干預，比較3 種運動方式對小鼠腸道菌群及糞便、血清中SCFA的影響，為運動改善腸道菌群和治療糖尿病提供新的研究依據(jù)和指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取C57BL/KS.db背景的雄性db/db小鼠40只，8周齡，隨機血糖≥300 mg/dL，購自南京大學南京生物醫(yī)藥研究院。所有動物飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑 Pusion Hot start flex 2×Master Mix，上海儀濤生物；DL2000 DNA Maker，Takara；Gene colour，北京金博益；Qubit dsNDA HS Assay Kit，Invitrogen，Life technologies；Biowest Agarose G-10，BIOWEST；50×TAE Buffer，上海生工；AMPure XT beads，Beckman；E.Z.N.A.?Stool DNA Kit，Omega Bio-Tek；甲醇、乙酸、丙酸，Merck，Darmstadt，Germany；2-乙基丁酸，Sigma-Aldrich；正己烷，上海阿拉丁。

1.3 實驗分組和運動方案 將40 只小鼠隨機分為4組，即有氧運動組（Y組）、抗阻運動組（K組）、有氧聯(lián)合抗阻運動組（L 組）和對照組（D 組），每組10只。D 組無運動干預，其余各組進行為期8 周的運動干預。

具體運動方案如下：（1）Y 組：采用坡度為0°的八跑道小鼠跑臺（北京東西儀器科技有限公司，型號:WDW-1）進行無負重跑臺運動，第1 周，小鼠每天運動30 min，運動速度10～15 m/min；第2～8周，小鼠每天運動60 min，運動速度15 m/min。（2）K組：采用自制的爬梯（長1 m，坡度為85°）進行尾部負重爬梯訓練，每天完成2組，每組3次不同負重的抗阻運動，第1周負重10%體重，第2周負重20%體重，第3周負重30%體重，第4周負重50%體重，第5～8周負重70%體重。（3）L 組：采取有氧運動與抗阻運動間隔進行的運動方式，周一、周三、周五進行抗阻運動訓練，運動方式、運動量及運動時間同K 組；周二、周四、周六進行有氧運動訓練，運動方式、運動量及運動時間同Y組。

1.4 血糖監(jiān)測 檢測小鼠的隨機血糖值。酒精消毒小鼠尾部末端，待干。取出血糖試紙（強生穩(wěn)豪試紙），插入血糖儀（強生穩(wěn)豪血糖儀），無菌醫(yī)用剪剪取小鼠尾部2 mm，待血液流出，使血液滴入血糖試紙血槽，數(shù)秒后，讀取血糖儀上的血糖數(shù)值并記錄。

1.5 取材 無菌管收集小鼠糞便并稱重，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）麻醉后進行眼靜脈叢取血，頸椎脫臼處死，低溫下1 000 r/min 離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.6 16S rDNA測序 使用Stool DNA Kit進行糞便DNA 提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，紫外分光光度計對DNA 進行定量，對糞便細菌16S rDNA 的V4 區(qū)進行PCR 擴增，引物為515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’）。PCR 反應體系：Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA 模板50 ng，ddH2O 定容至25 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用AMPure XT beads 試劑盒對目標片段進行回收，上機測序。

生物信息學分析：采用FLASH（v1.2.8）軟件，根據(jù)雙端序列的overlap 關(guān)系，將序列拼接（merge）成長的tag，并將序列上建庫引入的barcode 和引物序列去除，然后采用vsearch（v2.3.4）過濾嵌合體。預處理之后的cleandata使用Vsearch 將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OTU，挑選最佳的centroids（位于幾何中心）序列作為該OTU 的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析Alpha 多樣性。使用blast 進行序列比對，將OTU 代表序列與RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫）以及NCBI-16S 數(shù)據(jù)庫對每個代表性序列進行物種注釋。其他圖片使用R 包（V3.2.5）實現(xiàn)。

1.7 SCFA 檢測 SCFA 檢測采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進行檢測。配制乙酸、丙酸、丁酸的混合溶液后，再依次配制成0.000 1 μL/μL、0.000 7 μL/μL、0.001 4 μL/μL、0.007 1 μL/μL、0.014 3 μL/μL、0.017 9 μL/μL、0.035 7 μL/μL 的濃度梯度，使用7個濃度的標品樣本進行GC-MS檢測，根據(jù)不同濃度及相應濃度下標品的相對峰面積（標品峰面積/內(nèi)標峰面積）繪制標準曲線。樣本進行預處理后進行GC-MS檢測，根據(jù)繪制的標準曲線及待測樣本中該物質(zhì)的峰面積計算出該物質(zhì)在樣本中的含量。1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗；偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同運動方式對小鼠血糖的影響 Y 組、K 組和L 組小鼠運動干預8 周后的血糖均低于D 組，Y組、K 組和L 組之間小鼠血糖比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 各組小鼠運動干預后的血糖比較

2.2 OTU 分布Venn 圖 圖2 列舉了不同運動方式對小鼠共有以及特有菌種的數(shù)量，4組小鼠共有810種菌種為共有菌種，Y 組特有菌種有59 種，K 組有127種，L組有12種，D組有8種，Y組、K組和L組小鼠的特有菌種數(shù)量均高于D 組，說明3 種運動方式均有提高菌群種類的作用。

圖2 OTU分布Venn圖

2.3 不同運動方式對小鼠腸道菌群多樣性的影響 本研究以chao 1 指數(shù)和shannon 指數(shù)來評價小鼠腸道微生物的Alpha 多樣性，chao1 指數(shù)高，說明樣品物種數(shù)目越多，shannon 指數(shù)越大，多樣性越高[8]。運動干預8周后，4組小鼠chao 1指數(shù)和shannon 指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），K 組2型糖尿病小鼠的chao 1指數(shù)和shannon指數(shù)高于D組，Y 組chao 1 指數(shù)高于D 組，L 組shannon 指數(shù)高于D組（均P＜0.05）；各運動組chao 1指數(shù)比較無明顯差異（P＞0.05），K 組與L 組shannon 指數(shù)比較無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性比較

2.4 不同運動方式對小鼠門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響 在門水平上，K 組、Y 組、L 組、D 組小鼠的優(yōu)勢菌分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），約占97%～98%。K 組、Y 組、L組小鼠腸道放線菌門相對豐度分別為1.18（0.80～1.20）、0.39（0.24～0.75）、0.57（0.43～0.71），均高于D 組的0.36（0.22～0.61）（均P＜0.05），Y 組小鼠變形菌門的相對豐度[4.39（2.88～5.85）]低于D 組[9.36（7.38～13.22）]（P＜0.05），見圖4。

圖4 不同運動方式對小鼠菌群門水平結(jié)構(gòu)的影響

2.5 不同運動方式下小鼠屬水平上腸道菌群前20種菌屬熱圖分析 經(jīng)過8周的抗阻運動干預后，2 型糖尿病小鼠產(chǎn)SCFA 細菌羅氏菌屬（Roseburia）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對豐度升高，見圖5。

圖5 不同運動方式干預對小鼠菌群屬水平的影響

2.6 不同運動方式對2型糖尿病小鼠糞便SCFA的影響 K 組和L 組糞便乙酸含量高于D 組和Y 組，K 組糞便丙酸含量高于D 組、Y 組、L 組（P＜0.05）；各運動組糞便丁酸含量均高于D 組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組糞便中SCFA含量比較ng/mg，±s

表1 各組糞便中SCFA含量比較ng/mg，±s

與D 組比較，*P＜0.05；與Y 組比較，#P＜0.05；與L 組比較，&P＜0.05。

2.7 不同運動方式對小鼠血清SCFA 含量的影響K組、L組血清丁酸含量均高于D組（P＜0.05），但L組與K血清丁酸含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組間血清乙酸、丙酸含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 各組血清中SCFA含量比較ng/μL

3 討論

運動可改善患者的糖脂代謝和胰島素抵抗[9]。有研究對26例糖尿病患者進行為期12周彈力帶抗阻運動，結(jié)果顯示運動能明顯改善患者的糖化血紅蛋白、空腹、餐后血糖等指標[10]。另有研究報道，聯(lián)合運動比單純有氧運動更能顯著改善患者的血糖水平，提高生活質(zhì)量[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種運動均可改善2 型糖尿病小鼠血糖水平，但3 種運動方式在改善血糖水平上的效果無明顯差異，可能與運動的時間、強度及頻率不同有關(guān)。

徐山茸等[12]發(fā)現(xiàn)，運動干預后在校大學生OTU數(shù)目增加，提示運動可以提高物種豐富度。本研究發(fā)現(xiàn)，各運動組小鼠特有菌種OTU 數(shù)量均增加，說明3 種運動方式均可有效提高菌群種類。2 型糖尿病患者腸道菌群Alpha 多樣性降低，腸道菌群多樣性對2 型糖尿病的影響主要通過介導腸道菌群代謝[13]。本研究中，運動干預后的小鼠腸道菌群多樣性提高，這與Kern等[14]的運動訓練能提升腸道菌群多樣性的結(jié)果相一致，提示運動能提高腸道菌群的多樣性。

厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門為腸道優(yōu)勢菌，占總菌群的98%以上[15]。本研究結(jié)果顯示，4組小鼠的優(yōu)勢菌均分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門，說明運動不會對腸道菌群的主要優(yōu)勢菌的大結(jié)構(gòu)有明顯影響。但是經(jīng)過運動干預后，各運動組小鼠腸道放線菌門的相對豐度均上升，有氧運動還降低小鼠變形菌門的相對豐度。此外，抗阻運動顯著提高羅氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對豐度，羅氏菌屬是產(chǎn)丁酸鹽細菌[16]。有研究報道，運動改善了糖尿病前期患者葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性，該作用與腸道菌群的改變密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果亦證實，各運動組糖尿病小鼠在腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善的同時，血糖水平也得到顯著改善，提示運動改善血糖的可能途徑是影響腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)。

研究證實，SCFA 通過減少熱量攝入、降低血糖、改善胰島素抵抗和炎癥反應、增加胰高血糖素樣肽-1分泌來改善2型糖尿病[18]。運動會影響人體腸道菌群的組成及代謝，Matsumoto 等[19]最早報道了運動會改變盲腸的微生物組成，并且提高小鼠盲腸中正丁酸鹽濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，3種運動可提高2型糖尿病小鼠體內(nèi)SCFA 的含量，其中抗阻運動及聯(lián)合運動在提高SCFA 水平上的效果優(yōu)于有氧運動。

綜上所述，有氧運動、抗阻運動以及聯(lián)合有氧—抗阻運動均可改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平，運動可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，影響SCFA 的水平，運動改善血糖的另一個可能途徑是通過影響腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)及代謝。