楊雪梅，楊康明，李 娜

（1.甘孜州人民醫(yī)院麻醉科，甘孜 626000；2.甘孜州人民醫(yī)院肝膽一科，甘孜 626000；3.海南省人民醫(yī)院麻醉科，海口 572000）

急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是一種常見的急性疾病，死亡率很高，并且容易導(dǎo)致慢性腎病的進展[1]。腎缺血再灌注損傷（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是導(dǎo)致AKI 最重要的原因之一，常見于腎移植、腎部分切除術(shù)、休克、急性腎動脈阻塞和其他臨床手術(shù)過程[2]。自噬在RIRI中發(fā)揮著重要的作用。因此，開發(fā)一種能夠有效調(diào)控自噬的藥物將有助于RIRI 的治療。舒芬太尼（sufentanil，Sufen）是臨床最常用的麻醉藥物，具有鎮(zhèn)痛作用強、起效快、蘇醒時間短等優(yōu)點。有研究報道，Sufen通過抑制過度自噬可減輕大鼠RIRI[3]，但具體機制尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建RIRI 模型，探究Sufen對RIRI大鼠細胞自噬的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2021-0059。動物實驗均遵循3R原則，本研究得到甘孜州人民醫(yī)院動物倫理委員會的批準（倫理編號：2022-0175）。

1.1.2 主要試劑 枸酸舒芬太尼注射液（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002、肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；兔源一抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）、p62、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、GAPDH 及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（廣州復(fù)能生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理 將60 只SPF 級雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、Sufen 組、LY294002組、Sufen+LY294002 組，每組12 只。除對照組外，其它組均參考文獻[3]進行RIRI 模型構(gòu)建。建模成功后，Sufen 組大鼠在再灌注前5 min尾靜脈注射舒芬太尼1 μg/kg、腹腔注射0.3 mg/kg 生理鹽水[4]；LY294002 組大鼠在再灌注前5 min 尾靜脈注射1 μg/kg 生理鹽水，腹腔注射LY294002 0.3 mg/kg[5]；Sufen+LY294002組大鼠在再灌注前5 min尾靜脈注射舒芬太尼1 μg/kg、腹腔注射LY294002 0.3 mg/kg，對照組、模型組大鼠則尾靜脈注射1μg/kg 生理鹽水、腹腔注射0.3 mg/kg生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 大鼠血清中Cr和BUN水平的檢測 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血獲得血清，按照說明書步驟檢測大鼠血清中肌酐Cr和BUN水平。

1.2.3 蘇木精—伊紅（HE）染色檢測大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 每組3 只大鼠，處死大鼠取出腎臟固定在多聚甲醛中，切成5 μm厚切片，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化。參考文獻[6]進行腎臟組織病理評分，隨機選取6個不重疊的視野，根據(jù)腎小管壞死、管型形成和小管擴張的分級評分反映腎小管損傷嚴重程度：0 分（無損傷）、1 分（≤10%的損傷）、2 分（11%～25%的損傷）、3分（26%～45%的損傷）、4分（46%～75%的損傷）和5分（≥76%的損傷）。

1.2.4 大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平的檢測 每組3只大鼠，嚴格按照MDA含量、SOD活性檢測試劑盒說明書操作步驟檢測大鼠腎臟組織中MDA 含量、SOD活性。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察自噬小體的形成 取剩余6只大鼠腎組織，一部分將腎臟組織切成1 mm3的小塊，固定過夜后將組織樣本在室溫下用1%鋨酸固定1 h，在一系列乙醇水溶液中脫水，最后在100%乙醇中脫水，然后包埋在環(huán)氧樹脂中。使用超薄切片機切割的超薄切片用3%檸檬酸鉛染色，最后使用電子顯微鏡觀察自噬小體形成情況。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白表達 取“1.2.5項”中剩余腎組織，通過RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后，通過10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入一抗LC3、p62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗孵育1 h 后，加入ECL 試劑可視化蛋白，利用Image J 軟件分析目的蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平的比較

與對照組比較，模型組大鼠血清中Cr、BUN 水平升高；與模型組比較，Sufen 組大鼠血清中Cr、BUN 水平回降，LY294002 組大鼠血清中Cr、BUN水平回升；與Sufen組比較，Sufen+LY294002組大鼠血清中Cr、BUN水平升高，見表1。

表1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平比較±s，n=12

表1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平比較±s，n=12

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷嚴重，如出現(xiàn)白細胞浸潤，腎小管擴張，管型形成，病理評分升高；與模型組比較，Sufen 組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷減輕、病理評分降低，LY294002組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷加劇，病理評分升高；與Sufen組比較，Sufen+LY294002組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷嚴重、病理評分升高，見圖1和表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果

表2 各組大鼠腎臟組織病理評分比較±s，n=3

表2 各組大鼠腎臟組織病理評分比較±s，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.3 各組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中MDA含量升高，SOD 活性降低；與模型組比較，Sufen 組MDA 含量降低，SOD 活性升高，而LY294002 組MDA 含量升高，SOD 活性降低；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002組MDA含量升高，SOD活性降低，見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織中MDA含量、SOD活性的比較±s，n=3

表3 各組大鼠腎臟組織中MDA含量、SOD活性的比較±s，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.4 各組大鼠腎臟組織中自噬小體形成比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加；與模型組比較，Sufen組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量減少，LY294002組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加，見圖2。

圖2 透射電子顯微鏡觀察自噬小體的形成（×50 000）

2.5 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達降低；與模型組比較，Sufen 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，p62蛋白表達升高，而LY294002 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達降低；與Sufen組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達降低，見圖3和表4。

圖3 Western blotting檢測LC3、p62蛋白表達

表4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達比較±s，n=6

表4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達比較±s，n=6

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.6 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低；與模型組比較，Sufen組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平升高，而LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低，見圖4和表5。

圖4 Western blotting檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達

表5 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達比較±s，n=6

表5 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達比較±s，n=6

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

3 討論

據(jù)報道，RIRI 患者血液中Cr 和BUN 水平反映了腎功能損傷的程度，其水平越高，損傷越嚴重[7]。氧化應(yīng)激指標MDA可衡量氧自由基及脂質(zhì)過氧化水平對腎組織的損傷能力，而SOD的活性則反映了機體清除活性氧的能力。本研究結(jié)果表明，RIRI模型大鼠腎臟損傷嚴重，氧化應(yīng)激增強。腎細胞主要依靠自噬來促進細胞存活和恢復(fù)細胞穩(wěn)態(tài)，自噬可有效改善炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，而過度的自噬則可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強，細胞死亡增加。有研究報道，大鼠RIRI后腎組織的自噬活性升高[8]；LC3、p62蛋白是自噬過程中的關(guān)鍵蛋白，LC3蛋白存在LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種形式，可參與自噬小體的形成，而p62蛋白則參與自噬的降解。本研究結(jié)果提示RIRI 模型大鼠中存在過度自噬。

Sufen 是一種合成的阿片類鎮(zhèn)痛劑，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用；其通過抑制自噬水平在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮對心臟的保護作用；Sufen 預(yù)處理通過抑制氧化應(yīng)激和線粒體自噬來抑制大鼠心肌缺血再灌注引起的心肌損傷[9]。本研究結(jié)果提示，Sufen可能通過抑制氧化應(yīng)激及過度自噬來發(fā)揮對RIRI大鼠腎臟的保護作用。

研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kenase B，PI3K/AKT）通路可以改善腎臟、肺、腦等的缺血再灌注損傷。右美托咪定通過激活PI3K/AKT通路減輕大鼠肺缺血再灌注損傷[10]；丹紅注射液可激活PI3K/AKT 通路發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護作用[11]。本研究結(jié)果證明，在RIRI 模型大鼠中PI3K/AKT 通路被抑制，提示Sufen 可能通過激活PI3K/AKT通路來抑制過度自噬，進而發(fā)揮對RIRI大鼠腎臟的保護作用。本研究利用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，LY294002組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低，氧化應(yīng)激及自噬活性增強，腎臟損傷加??；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低，氧化應(yīng)激及自噬活性增強，腎臟損傷嚴重，證明了Sufen可能通過激活PI3K/AKT 通路來抑制過度自噬，進而發(fā)揮對RIRI大鼠腎臟的保護作用。

綜上所述，Sufen可能通過激活PI3K/AKT通路來抑制過度自噬，進而發(fā)揮對RIRI大鼠腎臟的保護作用。