劉 暢，張慧艷，常雨晴，鄧獻(xiàn)輝，宋志遠(yuǎn),2，趙前程,2,3，祁艷霞,2,3,

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023；2.遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗(yàn)與加工技術(shù)科技服務(wù)中心，遼寧大連 116023；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034）

海參（Sea cucumber，holothurians），屬棘皮動(dòng)物門海參綱，是具有悠久歷史的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。海參在我國(guó)南北方均有分布，其中，北方海參品種主要為仿刺參（Apostichopus japonicus），被譽(yù)為“參中之冠”[1]。海參中有很多對(duì)人體有益的活性成分。海參皂苷被認(rèn)為具有抗腫瘤[2]的作用，除此之外還有降血壓[3]和改善高尿酸血癥[4]等作用。海參多糖中的硫酸軟骨素對(duì)于關(guān)節(jié)炎和軟組織恢復(fù)[5]具有良好效果，另外也有抗血栓[6]和抗血小板聚集[7]等作用。海參肽是由海參制備的，由2~12 個(gè)氨基酸或者更多氨基酸組成的小肽或多肽[8]。海參肽的制備有水解法和酶解法，因?yàn)樗夥ㄖ袝?huì)用到酸或堿，危險(xiǎn)性較大，而且會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備造成一定的腐蝕，所以現(xiàn)在大部分海參肽制備都采用蛋白酶酶解法[9]，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等。除了利用外源酶，海參內(nèi)源酶也能對(duì)其自身進(jìn)行酶解，常被稱作海參的自溶，也被叫做海參的“吐腸”現(xiàn)象。海參可以在幾分鐘內(nèi)進(jìn)行自溶，體壁逐漸粘稠直至將自身溶為液態(tài)[10]，這也就造成了海參不易保存和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。

但海參自溶并非只有缺點(diǎn)，王靜等[11]利用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)海參自溶制備海參肽工藝進(jìn)行優(yōu)化，水解度可達(dá)38.8%；鄭杰等[12]以可溶性寡肽溶出率和還原糖溶出率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)自溶方法中可溶性寡肽和還原糖溶出率均顯著提高。這說(shuō)明海參的自溶現(xiàn)象極有被研究和利用的價(jià)值。海參肽還具有一定的生物活性，例如抗氧化、抗疲勞、抗衰老等，史亞萍等[13]報(bào)道酶解的海參肽具有羥基自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除力以及超氧陰離子清除力等多種良好的抗氧化能力。海參的生物活性也與肽的分子量有著密切的關(guān)系[14]，付學(xué)軍等[15]利用超濾的方法將不同分子量的海參肽分別進(jìn)行了抗氧化測(cè)定，結(jié)果顯示分子量（Mr）≤5 kDa 的海參多肽溶液具有更高的超氧陰離子清除能力，而Mr>10 kDa 的海參多肽羥基自由基清除能力較強(qiáng)。

為了制備高活性海參肽，本文采用人工引發(fā)海參體壁自溶獲得海參自溶肽，并與利用外源酶（胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶）對(duì)海參體壁進(jìn)行酶解得到的海參肽進(jìn)行對(duì)比，比較兩個(gè)過(guò)程中所產(chǎn)生的海參肽在分子量、氨基酸組成和體外抗氧化活性方面的差異，從而篩選海參肽的最優(yōu)制備方法，以期為海參肽的制備工藝提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參，屬檐手目 大連開(kāi)發(fā)區(qū)圈養(yǎng)；胰蛋白酶（2×106U/g）、堿性蛋白酶（2×106U/g）、中性蛋白酶（2×106U/g） 天津諾奧酶生產(chǎn)力促進(jìn)有限公司；三氯乙酸（TCA） >97%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；間苯三酚 >98%，上海麥克林生化科技有限公司；香草醛 98%，天津市大茂化學(xué)試劑廠；人參皂苷>99.5%、硫酸軟骨素>99.5%、肽分子量>99.5% 均為標(biāo)準(zhǔn)品，北京寶希迪商貿(mào)有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及氨基酸試劑盒 大連依利特股份有限公司；McⅡvaines 緩沖液：pH6.8 的磷酸二氫鈉-檸檬酸。

1260 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；BS224S 型精密電子天平 德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JYL-C16V 勻漿機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；STARTER2100 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司； HH-ZK4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ELx800 酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；SB-120D 超聲波清洗機(jī)、scientz 真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；CR21N 高速冷凍離心機(jī) 日立工機(jī)株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參多肽的制備 低溫保存的海參解凍去頭，去內(nèi)臟后將體壁清洗干凈。勻漿后均分為六份，自溶處理三份，酶解處理三份。自溶處理：采用紫外照射30 min 后，加入三倍體積的McⅡvaines 緩沖液在pH6.8，添加NaCl 至濃度為2%，溫度45 ℃靜置條件下進(jìn)行自溶，自溶時(shí)間分別為2、4、8 h。加入2 倍體積10% TCA 溶液終止自溶，靜置30 min，8000 r/min 離心15 min，取上清液凍干。酶解處理：熱水漂燙瀝干海參體壁水分后加入三倍體積水勻漿，勻漿液于100 ℃加熱10 min，冷卻至室溫后分別加入海參體壁質(zhì)量0.2%的堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，在各自最適條件（堿性蛋白酶：溫度45 ℃，pH10.0；胰蛋白酶：溫度37 ℃，pH8.0；中性蛋白酶：溫度45 ℃，pH7.0）下攪拌酶解，酶解4 h，沸水煮10 min 滅酶，加入2 倍體積10% TCA 靜置30 min，8000 r/min 離心15 min，取上清液凍干。

1.2.2 水解度（DH）的測(cè)定 水解度采用TCA 沉淀法[16]。N0采用凱氏定氮法測(cè)得；N1為海參體壁經(jīng)過(guò)勻漿后加入10% TCA 靜置反應(yīng)30 min 后的上清；N2為酶解或自溶反應(yīng)后加入10% TCA 靜置反應(yīng)30 min 后的上清。N1和N2均采用吸光光度法。利用雙縮脲法測(cè)定樣品在540 nm 處吸光度值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得肽的質(zhì)量。設(shè)定三組平行來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

式中：DH 表示水解度，%；N0-海參體壁總蛋白質(zhì)量，mg；N1-海參體壁中10% TCA 可溶性多肽質(zhì)量，mg；N2-反應(yīng)后自溶物或酶解液中10% TCA 可溶性多肽質(zhì)量，mg。

1.2.3 粗肽中活性成分含量測(cè)定

1.2.3.1 肽含量測(cè)定 取濃度為10 mg/mL 的各個(gè)海參肽粗品，利用Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c 軟件，通過(guò)檢測(cè)肽鍵在紫外205 nm 處的波長(zhǎng)來(lái)確定樣品中實(shí)際的肽（寡肽和多肽）濃度，與粗肽濃度10 mg/mL 相比較，進(jìn)而確定海參肽粗品中肽的含量。

1.2.3.2 皂苷含量測(cè)定 利用人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，依次加到6 支試管中后水浴蒸干試劑，再依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加熱15 min 后再立即用冰水冷卻5 min，加入5 mL 冰醋酸搖勻，靜置10 min，于560 nm 處測(cè)定吸光度[17]。準(zhǔn)確吸取200 μL 樣品，加入200 μL 正丁醇進(jìn)行萃取，反復(fù)三次氮?dú)獯蹈珊筮M(jìn)行同樣方法測(cè)定。

1.2.3.3 硫酸軟骨素含量測(cè)定 分別吸取1 mg/mL硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品溶液80、160、240、320、400 μL于10 mL 離心管中，用蒸餾水稀釋至400 μL，加入間苯三酚溶液1.2 mL，蓋塞混勻。將其置于沸水中水浴30 min，取出后立即冰水水浴冷卻5 min，用冰醋酸稀釋至4 mL，混勻，于558 nm 處測(cè)定吸光度[18]。樣品中硫酸軟骨素含量采用同樣的方法測(cè)定。

1.2.4 高效液相色譜測(cè)定海參肽分子量 色譜柱：Asahipak GS320-HQ；尺寸：7.5 mm×300 mm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.07 mol/L 磷酸鈉緩沖溶液（pH7）+0.15 mol/L NaCl 溶液；流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

1.2.5 高效液相色譜測(cè)定氨基酸組成 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行氨基酸成分測(cè)定[19]，具體洗脫條件見(jiàn)表1。前處理參考黃小蘭等[20]的方法進(jìn)行。

表1 色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1 羥基自由基的清除力測(cè)定 對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定主要參考夏吉安[21]的水楊酸法。具體操作略有修改：選取VC溶液作為對(duì)照品，濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/mL 的多肽樣品和對(duì)照品各0.5 mL，分別依次加入0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后搖勻，510 nm 處分別測(cè)定它們的吸光度值，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。

式中：A1：加入樣品和H2O2溶液的吸光度；A2：加入樣品，將H2O2換成等量蒸餾水溶液的吸光度；A0：未加入樣品溶液的吸光度。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 利用1.2.6.1配制好的VC對(duì)照組溶液，酶解液和自溶物的濃度梯度溶液來(lái)進(jìn)行DPPH 自由基清除能力的測(cè)定，在JOSé等[22]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，不同梯度樣品加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH，搖勻后靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)濃度的樣品做三個(gè)平行，按如下公式計(jì)算。

式中：B1：加入樣品和DPPH 溶液的吸光度；B2：加入樣品，將DPPH 換成等量無(wú)水乙醇溶液的吸光度；B0：未加入樣品溶液的吸光度。

1.2.6.3 Fe3+還原力的測(cè)定 Fe3+還原力的測(cè)定在KRISHNAMOORTHY 等[23]的方法上進(jìn)行改進(jìn)：取不同濃度的酶解液、自溶物和VC對(duì)照溶液0.2 mL，各加入0.5 mL PBS 緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）和0.2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，進(jìn)行50 ℃、20 min 的水浴，再加入1 mL 10 %三氯乙酸（TCA）溶液后離心（3000 r/min，10 min）。C1是取離心后上清液0.5 mL，加入0.5 mL 蒸餾水和0.1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，后搖勻后靜置10 min，用酶標(biāo)儀于700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，C2采用同樣的方法獲得，但其中不加入0.1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，每個(gè)濃度樣品做三組平行，利用公式求得Fe3+的還原能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin 9.1 和SPSS Statistics 22 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度差異比較

對(duì)不同方法制備海參肽的蛋白水解度進(jìn)行了比較，結(jié)果如表2 所示。通過(guò)不同來(lái)源的酶制備海參肽，海參蛋白的水解度由高到低的方法依次為：自溶8 h>自溶4 h>自溶2 h，胰蛋白酶酶解>中性蛋白酶酶解>堿性蛋白酶酶解。從自溶2 h 到8 h，水解度呈逐漸上升的趨勢(shì)，自溶8 h 樣品的水解度最大，可以達(dá)到51.0%。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)紫外照射，海參體壁中部分內(nèi)源酶家族通路被激活，從而導(dǎo)致一系列內(nèi)源酶對(duì)膠原蛋白的降解，所以隨著時(shí)間的增加，水解度逐漸增高。胰蛋白酶對(duì)于海參的水解效果較其它兩種外源酶效果更好，可達(dá)到18.8%，但整體外源酶對(duì)海參酶解的水解度較內(nèi)源酶低。采用內(nèi)源酶得到肽的水解度高與海參體內(nèi)含有的多種蛋白酶有關(guān)，海參體內(nèi)不僅含有能夠酶解膠原Ⅰ型蛋白的基質(zhì)金屬蛋白酶，還含有既能酶解膠原Ⅰ、Ⅱ型蛋白，又能酶解非膠原蛋白的組織蛋白酶K 等[10]。

表2 內(nèi)外源酶制備海參多肽的蛋白水解度Table 2 Proteolysis of sea cucumber peptides prepared by internal and external enzymes

2.2 粗肽組成分析

不同制備方法對(duì)海參肽組成的影響，結(jié)果如表3 所示。自溶和外源酶酶解方法中，整體來(lái)看，自溶所制備的粗肽中肽含量要高于外源酶酶解法，自溶8 h 得到的海參肽粗品中肽的含量最高，達(dá)到898.3 mg/g；堿性酶酶解制備的海參肽粗品中肽的含量最低，為142.0 mg/g。自溶所制備的粗肽中肽含量高的原因與自溶方法的水解度高于酶解方法有關(guān)，在利用10%TCA 來(lái)沉淀沒(méi)有被酶解的蛋白質(zhì)過(guò)程中，外源酶酶解海參所產(chǎn)生的部分大分子肽以及沒(méi)有被酶解的蛋白質(zhì)一起下沉變?yōu)槌恋?，在離心過(guò)程中被除去，導(dǎo)致外源酶酶解的方法中肽的含量沒(méi)有自溶方法高。除了肽以外，海參肽粗品中還含有硫酸軟骨素和皂苷等活性物質(zhì)。與自溶方法相比，外源酶酶解方法會(huì)產(chǎn)生更高含量的硫酸軟骨素和皂苷。其中胰酶酶解制備的海參粗肽中硫酸軟骨素和皂苷含量最高，分別為160.9 mg/g 和43.9 mg/g，其中皂苷含量與高子陽(yáng)[24]測(cè)定的格皮氏海參中總皂苷含量結(jié)果相近。自溶方法所產(chǎn)生的硫酸軟骨素和皂苷含量整體偏低，可能是因?yàn)閮?nèi)、外源酶酶切位點(diǎn)不同，導(dǎo)致硫酸軟骨素和皂苷從組織上脫落下來(lái)的較少[25?26]。由于制備過(guò)程加入了一定量的緩沖液，所以粗肽中除了以上活性成分以外，可能還含有一定量的鹽類物質(zhì)。

表3 不同方法制備的海參粗肽的組成Table 3 Contents of active ingredients in sea cucumber peptides prepared by different methods

2.3 高效液相色譜測(cè)定分子量結(jié)果

利用高效液相色譜對(duì)6 種方法制備的海參肽的分子量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 內(nèi)外源酶制備海參肽分子量色譜圖Fig.1 Molecular weight chromatogram of sea cucumber peptide prepared by internal and external enzymes

自溶方法制備的海參肽出峰時(shí)間在15~35 min之間，分子量較小，94 %左右的肽在35 min 左右出峰，對(duì)應(yīng)分子量＜314 Da。自溶制備的海參肽分子量雖然較小，但通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其中并無(wú)游離氨基酸，所以可以推測(cè)大部分為二肽、三肽。酶解法制備的海參肽出峰時(shí)間主要在10~20 min 之間，對(duì)應(yīng)的肽段分子量主要集中在1~8.15 kDa，具體分子量分布如表4所示。

表4 不同方法制備的海參肽分子量分布Table 4 Molecular distribution of sea cucumber peptides prepared by different methods

由10 個(gè)以上氨基酸組成的肽是多肽，而一些小肽僅有2~4 個(gè)氨基酸[27]。從分子量分布來(lái)看，自溶制備的海參肽大部分為小肽，這與鄭麗等[28]所測(cè)得的自溶扇貝加工廢棄物分子量很相近；外源酶酶解法制備的海參肽大部分為多肽，這與曹學(xué)彬等[29]利用酶解法獲得的海參肽分子量結(jié)果相似。一般來(lái)說(shuō)，小肽具有更高的生物活性，小肽可以被腸粘膜直接吸收，更利于人體消化[30]。自溶所產(chǎn)生的小肽可能會(huì)在藥學(xué)，生理等方面具有更大的利用潛力。

2.4 高效液相色譜測(cè)定主要氨基酸結(jié)果

通過(guò)對(duì)六種樣品的主要氨基酸組成（圖2、圖3）分析發(fā)現(xiàn)，主要氨基酸組成測(cè)定結(jié)果與分子量測(cè)定結(jié)果相符。不同方法制備的海參肽中氨基酸所占比例如表5 所示。

圖2 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品分離譜圖Fig.2 Separation spectrum of mixed amino acid standard products注：1. Asp 天冬氨酸，2. Glu 谷氨酸，3. Ser 絲氨酸，4. Arg 精氨酸，5. Gly 甘氨酸，6. Thr 蘇氨酸，7. Pro 脯氨酸，8. Ala 丙氨酸，9. Val 纈氨酸，10. Met 蛋氨酸，11. Cys 半胱氨酸，12.Ile 異亮氨酸，13. Leu 亮氨酸，14. Trp 色氨酸，15. Phe 苯丙氨酸，16. His 組氨酸，17. Lys 賴氨酸，18. Tyr 酪氨酸。

圖3 不同方法制備海參肽氨基酸色譜圖Fig.3 Chromatograms of amino acids of sea cucumber peptides prepared by different methods

表5 不同方法制備海參肽中氨基酸組成分析（mg/100 mg）Table 5 Analysis of amino acid composition in sea cucumber peptide prepared by different methods (mg/100 mg)

除了自溶2 h 和4 h 方法制備的海參肽，其它方法制備的海參肽都具有較全面的氨基酸組成。對(duì)所有樣品進(jìn)行游離氨基酸測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，所有海參肽中幾乎不含有游離氨基酸。在自溶2 h 和4 h的海參水解產(chǎn)物中只檢測(cè)到脯氨酸和纈氨酸，這可能是因?yàn)楹⒌慕Y(jié)蹄組織中膠原纖維是由海參多糖和膠原蛋白組成的，自溶時(shí)間較短的情況下，海參中的多糖水解酶先對(duì)多糖進(jìn)行水解，產(chǎn)生少量的肽段，在自溶8 h 時(shí)，膠原蛋白被內(nèi)源酶水解，肽段中氨基酸不斷脫落，氨基酸種類增多[10]。自溶8 h 制備的海參肽含有12 種氨基酸，其中脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸和苯丙氨酸含量較高，脯氨酸含量高達(dá)55.48 mg/100 mg，占自溶法所得的氨基酸總量的65%，作為蛋白質(zhì)中唯一的亞氨基酸，脯氨酸主要來(lái)自膠原蛋白的降解，說(shuō)明自溶法主要降解的是海參體壁中的膠原蛋白[31]。外源酶酶解制備的海參肽含有11~13 種氨基酸，含量較高的氨基酸有脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、絲氨酸、甘氨酸。雖然外源酶方法制備的海參肽中也含有較高含量的脯氨酸，但含量低于8.00 mg/100 mg，遠(yuǎn)低于自溶法海參肽中脯氨酸含量。自溶8 h 和外源酶酶解制備的海參肽中均檢測(cè)到四種呈味氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘氨酸，其中天冬氨酸和谷氨酸是參與腦組織生化代謝的重要氨基酸[32]。海參肽的氨基酸組成和序列對(duì)其抗氧化活性有較大影響[33]，但具體的抗氧化活性也和肽分子量大小、氨基酸特性和序列有關(guān)。

2.5 抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 羥基自由基清除能力測(cè)定 羥基自由基具有極高的氧化點(diǎn)位，是人體內(nèi)最為活躍的一種自由基，因此羥基自由基清除能力是判定抗氧化能力的重要指標(biāo)。整體來(lái)看（圖4），自溶法制備的海參肽羥基自由基清除能力要強(qiáng)于外源酶酶解法。在濃度10 mg/mL時(shí)，按照自溶2 h、自溶4 h 和自溶8 h、中性酶酶解、堿性酶酶解、胰酶酶解方法排序，羥基自由基清除率分別達(dá)到94.3%、93%、93.4%、73.0%、51.5%和63.5%。因?yàn)殡姆肿恿繉?duì)于羥基自由基清除能力影響很大，低分子量的肽通常比高分子量肽具有更高的羥基自由基清除能力[34]。自溶肽和外源酶酶解肽的羥基自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸增加，但在低濃度范圍內(nèi)自溶法對(duì)于羥基自由基的清除效果較酶解法更明顯。這是由于產(chǎn)生的肽可以作為電子和自由基結(jié)合成更穩(wěn)定的產(chǎn)物，阻止氧化反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生[35]。

圖4 不同方法制備海參肽羥基自由基清除能力Fig.4 The scavenging ability of hydroxyl radical of sea cucumber peptide prepared by different methods

2.5.2 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 如圖5 所示，隨著濃度不斷增加，三種自溶肽和外源酶酶解肽均呈現(xiàn)出良好的DPPH 自由基清除效果，DPPH自由基清除率在10 mg/mL 時(shí)最高，按照自溶2 h、自溶4 h 和自溶8 h、中性酶酶解、堿性酶酶解、胰酶酶解方法排序，DPPH 自由基清除率分別達(dá)到83.1%、82.1%、85.8%、63.4%、53.2%和68.3%。有研究報(bào)道，極性氨基酸的DPPH 自由基清除能力會(huì)比非極性氨基酸高出1.2 倍左右[36]。自溶與酶解所產(chǎn)生的極性氨基酸含量雖相近，但自溶物呈現(xiàn)出更高的DPPH 自由基清除效果，這與前面自溶方法的水解度更高以及分子量更低有關(guān)，氨基酸序列對(duì)自溶物活性也具有一定影響，具體機(jī)理有待近一步研究。

圖5 不同方法制備海參肽DPPH 自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of sea cucumber peptide prepared by different methods

2.5.3 Fe3+還原力測(cè)定 鐵氰化鉀在抗氧化劑作用下被還原成亞鐵氰化鉀，F(xiàn)e3+能和亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成普魯士藍(lán)色，所以Fe3+的還原力可以代表樣品的抗氧化能力[37]。如圖6 所示，自溶法和外源酶酶解法制備海參肽的Fe3+還原力都隨著樣品濃度的增加而增大，自溶肽的Fe3+還原力大于外源酶酶解肽。Fe3+還原力在10 mg/mL 時(shí)最高，按照自溶2 h、自溶4 h 和自溶8 h、中性酶酶解、堿性酶酶解、胰酶酶解方法排序，F(xiàn)e3+還原力分別達(dá)到0.737、0.742、0.740、0.146、0.138 和0.176。Fe3+還原力活性高低與前面兩種抗氧化能力測(cè)定結(jié)果基本一致。外源酶酶解肽中大分子多肽含量較高，直接影響了它的Fe3+還原力。因?yàn)殡牡腇e3+還原力除了受氨基酸親水性的影響，也與氨基酸的分子量密切相關(guān)[38]。有研究表明，分子量在1 kDa 左右時(shí)Fe3+還原能力相對(duì)較好，而酶解物中肽段分子量較大，從而導(dǎo)致整體的Fe3+還原能力降弱[35]。

圖6 不同方法制備海參肽鐵還原能力測(cè)定Fig.6 The iron reducing ability of sea cucumber peptide prepared by different methods

3 結(jié)論

本文采用自溶、外源酶酶解制備海參肽，并對(duì)其性質(zhì)及活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)自溶和外源酶酶解制備的海參肽在組成和生物活性上有較大差異。自溶方法得到的海參肽大部分為分子量小于314 Da 的二肽和三肽，在自溶8 h 時(shí)，氨基酸種類豐富，其羥自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力和Fe3+還原力較高；外源酶酶解制備的海參肽分子量大部分大于1 kDa，其羥自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力和Fe3+還原力較自溶肽低。通過(guò)對(duì)兩類方法制備海參肽的分析比較可知，自溶法制備的小分子海參肽活性較高，在醫(yī)藥及功能性食品等方面可能具有更高的利用潛力，但具體的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。該研究為海參肽的制備及海參的綜合利用提供了新的參考。