王紫倩，高勝，王銘，衡婭萍，吳禎禎，任占冬，朱玉嬋

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

槐米是豆科（Leguminosaesp.）植物槐（Sophora japonicaLinn）的蓓蕾采摘干燥后剔除枝梗及雜質(zhì)所得的產(chǎn)物?；泵字胁粌H擁有種類豐富的黃酮類成分，像蘆丁、槐二醇、槲皮素等，還有少量脂肪酸[1]，使其在抗菌消炎、清熱解毒、加快生命體新陳代謝[2]等方面具有顯著的藥理作用。黃酮類化合物對自由基的清除機制與目前最為常見的如BHA等這類合成抗氧劑大致相同。主要是利用自由基與氫結(jié)合，生成酚氧自由基。進一步再轉(zhuǎn)變?yōu)榘膈阶杂苫鵞3,4]，并中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達到抑制脂類過氧化的功效。因此可以有效阻止自由基在體內(nèi)的產(chǎn)生，減少基體的氧化損傷，是一種良好的天然非酶類抗氧化活性物質(zhì)。在醫(yī)藥、食品和護膚品方面具有較好的運用價值[4]。

目前，植物中黃酮類物質(zhì)的提取方法包括堿提酸沉法、乙醇回流法[5,6]等常用傳統(tǒng)的方法。黃酮類化合物在乙醇中具有較好的溶解度，這使乙醇回流法不僅成本較低，無環(huán)境污染，操作簡便，且產(chǎn)品安全，被廣泛采用。在此基礎(chǔ)上，為了進一步提高提取效率，更多的學(xué)者選擇使用超聲輔助，微波輔助和加壓溶劑法[7,8]等方法進行輔助提取。但這些方法都是基于通過引入特殊儀器（超聲、微波和加壓）來提高提取效果。本文則從處理溶劑角度上進行考慮，在常規(guī)乙醇回流法過程前面引入酸性氧化電解水（acidic electrolyzed oxidizing water，AEOW）預(yù)處理步驟，希望能通過簡單AEOW預(yù)處理過程起到破壞槐米植物細胞的作用，從而為后續(xù)乙醇回流萃取提供輔助提高作用。因為AEOW具備三大特點：低pH值、高氧化還原電位值、擁有一定的有效氯含量（available chlorine content, ACC）[9,10]。這使其可通過氧化作用破壞生物細胞表面結(jié)構(gòu)，增加膜通透性[11-13]，增加物質(zhì)溶出效果。本文包括單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化實驗，確定了提取槐米總黃酮的最佳工藝。同時通過測定清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基和羥基自由基的效果，評估槐米黃酮的抗氧化能力。綜上所述，本文旨在探究AEOW對槐米的預(yù)處理輔助提取作用，考察其對總黃酮提取的增效作用，為植物總黃酮提取方法提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槐米，本實驗采購于武漢市藥店。1,1-二苯-2-苦肼基（DPPH），分析純，Macklin；蘆丁（95%），國藥試劑；乙醇、氯化鈉、重鉻酸鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、硫酸、鉻酸鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵的純度均為分析純，國藥試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PS-3005D直流穩(wěn)壓電源，深圳兆信電子儀器設(shè)備廠；HJ-1型磁力攪拌器，榮華儀器制造有限公司；DF-101s（加深）集熱式磁力攪拌器；SHZ-D型真空泵，上海力辰科技有限公司；BS210S型電子天平，德國賽多利斯集團；DHG-9147A型恒溫干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；721型可見分光光度計，上海菁華儀器有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FW100型植物粉碎機，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

整個實驗流程如圖1所示，首先在自制電解槽中制備所需的酸性氧化電解水，其次利用酸性氧化電解水對槐米進行預(yù)處理，然后采用乙醇回流法提取黃酮類物質(zhì)，最后通過分光光度法測試其體外抗氧化活性。

1.3.1 酸性氧化電解水的制備與測定

1.3.1.1 酸性氧化電解水的制備

參考文獻[13]的方法，在圖1所示的自制電解槽中，用均相陽離子交換膜將電解槽分隔為陰極區(qū)和陽極區(qū)。陰陽極分別是純鈦板和自制釕銥氧化物電極。電解過程中，以0.1%～0.2%的NaCl溶液（400 mL）為電解質(zhì)，電極間距2 cm，電極有效面積3.50 cm2，電流密度為60～70 mA/cm2，電解電壓為20 V。當(dāng)電解時間分別為10、30、60、75和90 min時，制得的電解水有效氯含量分別是13.61、52.94、114.33、166.10、205.47 mg/L。利用酸度計測定其pH=2.00±0.10，氧化電位值為1100±50 mV。

1.3.1.2 有效氯含量的測定

采用碘量法進行測定。先對陰涼避光靜置兩周后的Na2S2O3溶液標(biāo)定。取制得的酸性氧化電解水25 mL，加入KI固體0.50 g后移取2 mol/L的H2SO4溶液10 mL于碘量瓶中，暗處反應(yīng)10 min。稀釋標(biāo)定后的Na2S2O3溶液，用其滴定至溶液為淺黃色時加入1 mL的1%淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍色剛好消失，滴定終點以半分鐘內(nèi)顏色不變?yōu)橹笜?biāo)。記錄所用Na2S2O3溶液體積V。有效氯含量計算公式：

1.3.2 槐米總黃酮的提取

將實驗所購買的槐米用去離子水沖洗洗凈，放入60 ℃的恒溫干燥箱中干燥。用植物粉碎機進行粉碎并用50目篩過濾，獲得試驗所需槐米粉末。稱取2 g，在一定的有效氯濃度和預(yù)處理時間條件下進行浸泡預(yù)處理，隨后改變乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比進行回流提取。回流2 h后將所得的提取液抽濾離心，并取定量上層清液，用60%的乙醇定容至100 mL，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總黃酮的測定

1.3.3.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

用分析天平精準(zhǔn)稱取10.0 mg的蘆丁黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，溶于95%乙醇中，制備1 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別注入7個10 mL容量瓶中，依次標(biāo)號0、l、2、3、4、5和6。加入5% NaNO2溶液l mL，搖勻，放置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液l mL，搖勻，放置6 min；隨后加入4% NaOH溶液5 mL，95%乙醇定容。放置15 min后，以0號容量瓶為參比對照，吸光度測于510 nm處。然后樣品測定吸光度3～5次取其平均值。數(shù)據(jù)結(jié)果以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)，可以求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Y=0.0101X+0.0069，R2=0.9996。

1.3.3.2 槐米總黃酮的測定

參照米智等[14]的方法。移取存貯液0.30 mL于50 mL容量瓶，純水定容。根據(jù)“1.3.2.1”中所述操作。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出黃酮質(zhì)量濃度和得率。

黃酮得率的計算公式：

式中：

γ——得率，mg/g；

c——計算出的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

k——黃酮類物質(zhì)提取液的稀釋倍數(shù)；

v——總黃酮提取液的體積，mL；

m——樣品總質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

在確定提取溫度70 ℃，提取時間120 min的條件下，分別設(shè)置不同單因素實驗水平：有效氯濃度13.61、52.94、114.33、166.10、205.47和322.22 mg/L；預(yù)處理時間0、2、4、6和8 h；乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%和90%；液料比10:1、20:1、30:1、40:1和50:1 mL/g。探究其對總黃酮得率的影響，依據(jù)結(jié)果，確定最終響應(yīng)面實驗因素的具體水平。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，將總黃酮得率作為實驗響應(yīng)值。利用軟件Design-Expert，設(shè)定有效氯含量（A）、預(yù)處理時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和液料比（D）為自變量的4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗。實驗共29個試驗點（含5個重復(fù)試驗為零點）。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.6 槐米黃酮體外抗氧化活性試驗

1.3.6.1 DPPH自由基的清除能力測定

參考文獻[15]的方法并加以修改。取最佳條件下獲得的黃酮提取液，用60%乙醇定容成100 mL，然后從中分別移取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.00 mL液體到比色管中，分別用去離子水稀釋成10.00 mL。然后分別取4.00 mL樣品稀釋液和4.00 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）于比色管中，室溫避光反應(yīng)15 min，520 nm下測定吸光度值。

式中：

Ai——樣品吸光度；

Ax——乙醇代替DPPH溶液吸光度；

A0——空白對照（純水替代樣品）。

1.3.6.2 羥基自由基的清除能力測定

參考文獻[16]的方法并加以修改。配制不同濃度的提取液，依次加入FeSO4溶液（10.0 mmol/L）、H2O2溶液（8.8 mmol/L）、樣品溶液和水楊酸溶液（10.0 mmol/L）各1.00 mL，用去離子水定容至10 mL。37 ℃水浴反應(yīng)15 min后，510 nm處測定吸光度。

式中：

Ai——樣品吸光度；

Ax——去離子水代替H2O2溶液吸光度；

A0——空白對照（純水替代樣品）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

多次平行實驗，采用Origin 2017和Design-Expert V8.0.6.1軟件對試驗進行數(shù)據(jù)處理分析與因素相互關(guān)系的作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 有效氯濃度

由圖2可知，經(jīng)酸性氧化電解水處理2 h后，槐米總黃酮得率最高為20.88%，其比純水對照組（得率4.01%）得到了明顯的提高。以此數(shù)據(jù)為進一步探究基礎(chǔ)，評估槐米黃酮得率受不同有效氯濃度的酸性氧化電解水的影響。當(dāng)有效氯含量分別為13.61、52.94、114.33、166.10、205.47和322.22 mg/L時，其黃酮得率分別為7.16%、8.92%、13.79%、17.20%、19.40%和20.88%。由數(shù)據(jù)可知，電解水中有效氯含量與總黃酮的得率成正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)有效氯從52.94 mg/L上升到205.47 mg/L時，總黃酮得率從8.92%增加到從19.40%，其增長率是117.49%；而當(dāng)有效氯濃度從205.47 mg/L增加到322.22 mg/L時，其增長率僅為7.63%，即黃酮得率不再有明顯的提高。這可能因為較高濃度的電解水具有一定的抑制性，同時會在一定程度上氧化破壞黃酮的結(jié)構(gòu)[13,17]，致使得率不再增加。

2.1.2 預(yù)處理時間

由圖3可知，槐米經(jīng)酸性氧化電解水浸泡預(yù)處理后，其總黃酮得率隨時間增長呈現(xiàn)出先升后降的走向，并在2 h時達到最大值。如圖2所示，當(dāng)預(yù)處理時間從0 h增加到2 h時，槐米總黃酮得率從10.87%增加到最大值19.04%；但得率在預(yù)處理時間超過2 h后就開始下降。得率升高的原因是隨著預(yù)處理時間的增加，酸性氧化電解水會加速生物細胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，增大細胞膜的通透性[18,19]，有益加快黃酮類物質(zhì)溶出效果，進而提高得率。但浸泡時間過長時，會損壞黃酮類物質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)，致使得率降低。因此，將預(yù)處理時間定在2 h比較合適。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

如圖4所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不超過70%時，得率處于一直增加的趨勢，并在70%時達到最大值。黃酮類物質(zhì)是含有羥基的有機大分子，極性與乙醇較為接近[20,21]，同時乙醇會增加植物細胞的組織滲透性，使細胞中的黃酮類物質(zhì)充分溶解在溶液中，增加了其溶解性，進而使得率提升。然而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，不僅會使黃酮成分溶解，還促進了與乙醇分子結(jié)合的色素、醇溶性雜質(zhì)等成分的溶出，與黃酮物質(zhì)形成競爭關(guān)系，使得率降低。因此后期呈現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。

2.1.4 液料比

如圖5所示，當(dāng)液料比10:1 mL/g變化到30:1 mL/g時，得率逐漸增大，且在液料比為30:1 mL/g時達到最大值18.44%。持續(xù)增大配比中的溶劑量，得率反而下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象是因為隨著提取溶劑量的逐漸增大，槐米細胞與溶劑中的黃酮濃度差也會隨之增大，同時增加了傳質(zhì)推動力[22]，所以溶出的總黃酮類含量就會增加。但是當(dāng)液料比達到30:1 mL/g后，槐米中大部分黃酮都已經(jīng)被提取溶出進入溶劑之中，基本達到飽和狀態(tài)，溶劑量的繼續(xù)增加，使原本溶解到溶液中的黃酮質(zhì)量濃度被稀釋[21-23]，得率下降。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立

根據(jù)表2設(shè)計的因素和水平，以槐米總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，自變量選擇有效氯含量（A）、預(yù)處理時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、液料比（D），采用BBD實驗設(shè)計法進行響應(yīng)面設(shè)計。實驗結(jié)果如表2所示。對黃酮得率與有效氯濃度、預(yù)處理時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比之間的作用關(guān)系進行回歸分析。得到回歸方程：Y=18.95+0.56A+0.50B-0.19C+0.18D+ 0.53AB-1.30AC+0.95AD+0.50BC+0.33BD-0.27CD- 0.81A2-0.86B2-0.80C2-1.16D2，其中Y為黃酮得率的預(yù)測值。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 2 Design and analysis results of response surface experiments

2.2.2 回歸方程的驗證

如表3所示，對上述回歸方程進行了方差分析校驗。由圖可知，模型的p<0.0001，并且決定系數(shù)R2=0.9543，R2adj=0.9086，說明該模型極顯著。同時，失擬項不顯著（p=0.1266>0.05），在統(tǒng)計學(xué)上有意義。該回歸模型與實際提取過程具有極高的擬合程度，可用于分析總黃酮得率隨因素變化的趨勢及產(chǎn)率預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

四個因素對黃酮得率影響的主次關(guān)系可以通過F值的大小分別進行判定：A（有效氯含量）>B（預(yù)處理時間）>C（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>D（液料比）。其中因素A、B，交互作用項AB、AC、AD和二次項A2、B2、C2、D2對試驗指標(biāo)有極為顯著的影響（p<0.01），交互作用項BC對試驗有顯著的影響（p<0.05），其余項對試驗指標(biāo)的影響則不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件，針對各因素之間的交互 作用關(guān)系進行分析，并作出響應(yīng)曲面和等高線圖。響應(yīng)曲面中所示的陡峭程度和等高線橢圓率數(shù)值大小可以有效的判斷出因素之間交互作用關(guān)系強弱的程度。曲面越陡峭，等高線橢圓率越大[22,23]，則可證明交互關(guān)系越顯著。由圖6、圖7和圖8可看出，交互作用AB、AC、AD的響應(yīng)曲面陡峭且圖中的等高線較為扁平，橢圓率較大，因此證實了以上三種交互作用對總黃酮得率有較為顯著的影響。其余圖中響應(yīng)曲面比較平滑，橢圓率較小，說明交互作用BC、BD、CD對響應(yīng)值的影響較小。

2.2.4 試驗結(jié)果驗證

依據(jù)響應(yīng)面所示模型和結(jié)果分析，得到提取槐米總黃酮的最優(yōu)工藝：有效氯濃度250.00 mg/L，預(yù)處理時間161.70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60.93%，液料比36.63:1 mL/g，在此條件下槐米總黃酮的得率最高，可達20.00%。因此最佳工藝調(diào)整為：有效氯濃度250.00 mg/L，預(yù)處理時間162 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，液料比37:1 mL/g，在此條件下重復(fù)進行3次試驗。結(jié)果表明，在最優(yōu)實驗工藝條件下，黃酮平均得率為19.67%，與估測值相差0.33%，說明該模型可靠性較高，可以較好模擬槐米總黃酮的提取條件，且預(yù)測的黃酮得率準(zhǔn)確。

目前，已報道的輔助提取技術(shù)有超聲波、微波和加壓等。其中，張堃等[24]利用超聲波輔助提取槐米黃酮，得到乙醇濃度70%，溫度25 ℃，超聲提取時間35 min，料液比1:40 g/mL的最佳提取條件，此工藝下槐米黃酮得率為15.47%。初麗媛[25]采用加壓溶劑提取法，得到最優(yōu)工藝是溫度130 ℃，料液比1:40 g/mL，時間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，壓力0.4 MPa，槐米黃酮得率為19.40%。肖夢媛等[6]通過正交實驗設(shè)計法比較了醇提法、超聲波提取和微波提取三種常見提取槐米總黃酮的工藝，其中最佳工藝下得率分別是10.40%、2.49%和8.18%。本文采用的酸性氧化電解水預(yù)處理-乙醇回流兩步提取法，能較大幅度地提高總黃酮得率，并優(yōu)于常見的輔助提取方法。另外，該方法不需要使用超聲波、微波等特殊儀器，預(yù)處理過程簡單，可操作性強，其為植物中總黃酮的提取提供一個新思路。

2.3 槐米總黃酮抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

黃酮類物質(zhì)可以提供質(zhì)子與DPPH自由基結(jié)合而形成一種穩(wěn)定的抗磁性分子，降低DPPH自由基的含量[26]。由表4數(shù)據(jù)可知，提取液中總黃酮的濃度和對DPPH自由基的清除率成正相關(guān)關(guān)系。在提取液中總黃酮的濃度為2.36 mg/mL時，清除率達到最大值96.38%±0.48%。即使?jié)舛冉档偷?.47 mg/mL，相應(yīng)的清除率仍達到91.86%±0.32%。Jun X等[3]探討了在PSE條件下得到的槐米黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基清除效果，證實其濃度與清除率的顯著相關(guān)性，當(dāng)提取物濃度由0.1 mg/mL上升到0.9 mg/mL時，清除率從29.56%±2.48%增加到90.5%±2.92%。與本文結(jié)果相近，說明槐米總黃酮在抗氧化方面有較大的應(yīng)用價值。

2.3.2 羥基自由基清除能力分析

羥基自由基是一種易使蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)發(fā)生氧化損傷的活躍自由基[27]。清除羥基自由基在人體內(nèi)的產(chǎn)生可以有效的提高機體抗氧化性能。表4數(shù)據(jù)表明，隨著提取液中總黃酮濃度的增加，對羥基自由基清除率逐漸升高，呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。當(dāng)濃度達到2.36 mg/mL時，清除率高達92.30%±0.24%，且當(dāng)濃度大于0.40 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率均在85%以上。王益莉等[1]研究發(fā)現(xiàn)槐米提取液在1 mg/mL的濃度下對羥基自由基的清除率約為89.00%，這說明槐米總黃酮具有較為良好的抗氧化效果。

3 結(jié)論

試驗采用自制酸性氧化電解水對槐米進行預(yù)處理后，采取乙醇回流法提取槐米中的黃酮類化合物，并探究其體外抗氧化活性。依據(jù)單因素實驗所得出的結(jié)果，設(shè)計響應(yīng)面實驗，分析得出最佳提取槐米總黃酮的工藝參數(shù)：即有效氯濃度250 mg/L，預(yù)處理時間161.70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60.93%，液料比36.63:1 mL/g，在此工藝下得率為19.67%，與模型預(yù)期值僅差0.33%，證實了該工藝可行。實驗利用酸性氧化電解水（有效氯含量ACC=205.40 mg/L）對樣品進行浸泡預(yù)處理，在相同條件下，比實驗中對照組提高4.84倍，說明預(yù)處理效果顯著。另外，槐米總黃酮清除DPPH自由基和羥基自由基的效果隨其濃度的上升而增強。當(dāng)黃酮濃度達到2.36 mg/mL時，清除DPPH自由基與羥基自由基效率最高可分別達96.38%和92.30%，這表明槐米黃酮提取液具有良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果將為植物黃酮類成分提取提供一個較為新穎的思路，為其得率的提高方法提供新依據(jù)。