孫建榮，黨曉敏，王煥煥

1.延安大學附屬醫(yī)院東關(guān)分院老年呼吸科，陜西 延安 716000；

2.西安交通大學附屬醫(yī)院第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710061；

3.延安大學學附屬醫(yī)院東關(guān)分院重癥醫(yī)學科，陜西 延安 716000

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺內(nèi)和(或)肺外多因素引起的急性進行性呼吸衰竭，患者臨床多表現(xiàn)為呼吸頻速、窘迫，頑固性低氧血癥等[1]。盡管學者們對ARDS的發(fā)病機制和治療不斷探索，但數(shù)據(jù)顯示在過去的10年里，ARDS的發(fā)病率及病死率并未得到顯著降低，院內(nèi)死亡率高達40%～60%[2]。已有相關(guān)研究指出，ARDS患者疾病嚴重程度與治療反應(yīng)性明顯相關(guān)，根據(jù)疾病嚴重程度給予不同治療措施有助于降低臨床決策的失誤[3-4]。因此，尋找一種能夠輔助判斷患者疾病發(fā)展嚴重程度和評價預(yù)后好壞的指標，對于觀察ARDS患者治療效果和指導(dǎo)下一步治療方案，從而最終降低死亡率具有重要意義。miRNA-200c-3p通過基礎(chǔ)實驗已被驗證可參與ARDS的發(fā)病機制，但是其在臨床中的意義仍不清楚[5-6]。本文旨在通過相關(guān)分析研究其表達與ARDS診斷和臨床指標的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年7月至2020年4月延安大學附屬醫(yī)院東關(guān)分院重癥監(jiān)護室收治的118例ARDS患者作為病例組。納入標準：①診斷標準均符合ARDS柏林標準；②臨床資料完整；③年齡≥18歲。排除標準：①肺部嚴重疾病行肺部手術(shù)者；②有神經(jīng)或精神疾病不能配合者；③有嚴重肝、腎、心等重要器官嚴重疾病者。118例ARDS患者中男性52例，女性66例；年齡18～80歲，平均(65.38±12.71)歲。所有患者隨訪時間為21 d，根據(jù)患者的生存狀態(tài)分為存活組(n=41)和死亡組(n=77)。選取同期在我院體檢的118例健康者作為對照組，其中男性55例，女性63例；年齡18～78歲，平均(64.87±12.15)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、SOFA評分、是否有創(chuàng)機械通氣、是否接受CRRT、是否接受ECMO、是否糖皮質(zhì)激素治療、ARDS分型、ARDS分級和肺泡動脈氧分壓差[P(A-a)O2]，其中以miRNA-200c-3p表達的中位數(shù)分為低表達組和高表達組；P(A-a)O2按照既往研究結(jié)果分為≤153 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和＞153 mmHg組[7]；將SOFA評分分為＜4分、4～6分和＞6分三組，將ARDS分型分為肺內(nèi)型組和肺外型組，ARDS分級參考柏林標準依據(jù)氧合指數(shù)(oxygenation index，OI)分 為 輕 度(200 mmHg＜OI≤300 mmHg)、中 度(100 mmHg＜OI≤200 mmHg)和重度(OI＜100 mmHg)三組。

1.3 miRNA-200c-3p的檢測方法分別收集5 mL病例組和健康組靜脈血，室溫靜置1 h后，4℃、3 500 r/min離心10 min。將上層血清轉(zhuǎn)移到新的收集管，4℃、16 000 r/min離心10 min，除去細胞碎片，于-80℃保存。采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從血清中提取總RNA，采用Mir-XmiRNA First-Strand Synthesis和SYBR RT-qPCR(實時熒光定量PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。反應(yīng)生成的cDNA模板10倍稀釋后進行RT-qPCR。miRNA-200c-3p的上游引物5'-TAATACTGCCGGGTAATGATGGA-3'，下 游 引 物5'-TACTGCCGGGTAATGATGGAGGC-3'。U6的上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'。使用QuantStudioTM7 Flex RT-qPCR儀(美國ABI公司)進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸20 s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，以U6為內(nèi)參基因，基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.4 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗；運用單因素和多因素COX回歸分析研究影響病例組患者預(yù)后的獨立危險因素。采用Pearson相關(guān)性分析miRNA-200c-3p與APACHEⅡ評分的相關(guān)性，并繪制相關(guān)性散點圖。采用Medcalc軟件繪制受試者工作特征曲線(ROC)分析miRNA-200c-3p的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的miRNA-200c-3p表達水平比較病例組患者的miRNA-200c-3p相對表達量為8.17±1.17，明顯高于健康組的3.22±0.89，差異有統(tǒng)計學意義(t=36.578，P＜0.05)。

2.2 影響ARDS預(yù)后的危險因素單因素和多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，除年齡、ARDS分級和P(A-a)O2外，miRNA-200c-3p也是影響ARDS預(yù)后的獨立危險因素(P＜0.05)，見表1。

表1 影響ARDS患者預(yù)后的單因素和多因素COX回歸分析

2.3 miRNA-200c-3p的表達與臨床指標的關(guān)系mi RNA-200c-3p表達與年齡、ARDS分型和P(A-a)O2相關(guān)(P＜0.05)，其中年齡＞60歲、ARDS分型越嚴重和P(A-a)O2＞183.5 mmHg顯示miRNA-200c-3p的表達更高，見表2。

表2 miRNA-200c-3p表達與臨床指標的關(guān)系

2.4 miRNA-200c-3p判斷預(yù)后的價值根據(jù)ARDS患者預(yù)后情況，使用ROC曲線分析判斷miRNA-200c-3p對預(yù)后的價值，結(jié)果顯示，miRNA-200c-3p的AUC為0.847(95%CI：0.769～0.907)，特異性為86.29%，敏感性為83.63%，見圖1。

圖1 miRNA-200c-3p判斷ARDS患者預(yù)后的ROC曲線

2.5 miRNA-200c-3p和OI水平的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miRNA-200c-3p和OI水平存在明顯的負相關(guān)(r=-0.753，P＜0.01)，見圖2。

圖2 P(A-a)O 2和OI水平的相關(guān)性離散圖

3 討論

ARDS的發(fā)病機制為肺泡組織的急性炎癥反應(yīng)，患者肺組織損傷導(dǎo)致肺換氣功能障礙，肺通氣/血流比例失調(diào)，肺順應(yīng)性降低，患者常因呼吸衰竭而需要接受機械通氣治療以減少肺損傷[8]。對ARDS患者病情和預(yù)后的準確評估是全面、有效、綜合性治療的前提條件，是控制病情發(fā)展、降低病死率、改善預(yù)后效果的關(guān)鍵。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200c-3p可通過上調(diào)核因子-κB來降低ACE2的表達，進而促進ARDS引起的急性肺損傷[5]。此外，miRNA-200c-3p還可受lncRNA的調(diào)控，進而參與急性呼吸窘迫綜合征人肺上皮細胞的凋亡[6]。但是目前的文獻僅停留在miRNA-200c-3p的致病機制研究上，并未從臨床相關(guān)角度分析miRNA-200c-3p與ARDS的關(guān)系。因此，本文就這一方面展開研究。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-200c-3p在病例組中的相對表達量顯著高于健康組。單因素和多因素COX回歸分析顯示，除年齡、ARDS分級和P(A-a)O2外，miRNA-200c-3p也是影響ARDS預(yù)后的獨立危險因素。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-200c-3p表達還與年齡、ARDS分型和P(A-a)O2相關(guān)。對于年齡＞60歲、ARDS分型越嚴重和P(A-a)O2＞183.5 mmHg的患者，其miRNA-200c-3p的表達更高。上述結(jié)果提示miRNA-200c-3p在ARDS患者的預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)ARDS患者預(yù)后情況，使用ROC曲線分析判斷miRNA-200c-3p對預(yù)后的價值，結(jié)果顯示，miRNA-200c-3p的AUC=0.847(95%CI：0.769～0.907)，特異性為86.29%，敏感性為83.63%，說明miRNA-200c-3p在判斷ARDS患者預(yù)后方面具有很高的價值。Pearson相關(guān)分析顯示，miRNA-200c-3p和OI水平存在明顯的負相關(guān)。OI是指動脈氧分壓(PaO2)與吸入氧濃度(FiO2)比值的百分比，即OI=PaO2/FiO2。2012年公布的ARDS柏林定義(Berlin definition)將其作為評估患者病情嚴重程度和預(yù)后的有效指標[9]。若患者疾病進展，嚴重程度加重，則其OI水平明顯下降，P(A-a)O2則逐漸增大；反之則表明治療有效。本研究中Pearson相關(guān)分析顯示miRNA-200c-3p的表達情況和OI水平存在明顯的負相關(guān)(r=-0.753，P＜0.01)，提示在臨床中miRNA-200c-3p的連續(xù)監(jiān)測同樣有助于反映患者病情變化以及預(yù)后評估。此外，P(A-a)O2是判斷肺內(nèi)氣體交換功能異常與否、評價肺功能損傷程度的指標，主要受解剖分流情況、通氣/血流比例、肺泡毛細血管彌散功能影響，與肺機能呈負相關(guān)[10-11]。P(A-a)O2＞153 mmHg患者的HR為P(A-a)O2≤153 mmHg患者的4.363倍(95%CI：3.578～5.117)，提示P(A-a)O2數(shù)值的高水平則死亡風險更高，預(yù)后更差，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[12-14]。

綜上所述，miRNA-200c-3p是影響ARDS預(yù)后的獨立危險因素，密切監(jiān)測miRNA-200c-3p在一定程度上可以評估患者病情嚴重程度和預(yù)測患者預(yù)后，具有一定的臨床意義。