羅偉斌，曹揚(yáng)建，吳爾文，趙振剛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

涼粉草（Mesona chinensisBenth.）又名仙草、仙人草，為唇形科涼粉草屬一年或多年生草本植物，廣泛分布于東南亞和我國(guó)江西、廣東、福建、廣西、云南等地[1-2]。我國(guó)涼粉草資源豐富、價(jià)格低廉，有廣闊的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用前景[2]，涼粉草在日常飲食中被用作黑涼粉的原料，也被用于生產(chǎn)制作涼茶、龜苓膏等食品，涼粉草資源的生產(chǎn)加工附加值較低。涼粉草精油（Mesona chinensisBenth. essential oil，M.EO）作為涼粉草中具有活性的組分之一，其受到的關(guān)注較少，現(xiàn)有的一些研究報(bào)道集中在其組分的種類及含量分析[3-5]，鮮有關(guān)于抗菌活性的報(bào)道[6-7]。植物精油為高附加值的產(chǎn)品，因此研究M.EO的生物活性將為涼粉草資源的高值化開(kāi)發(fā)與利用提供新的思路和理論依據(jù)。

植物精油是天然的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其除了具有芳香氣味外，還具有抗氧化、抗增殖、抗炎、抗菌、抗病毒等活性，因此在食品、日化、醫(yī)療保健等領(lǐng)域廣受關(guān)注[8-9]。但是，植物精油的水溶性差、易揮發(fā)，且對(duì)溫度、光照等條件敏感，在實(shí)際應(yīng)用中受到極大限制。

微乳液是由一定比例的油相、水相、表面活性劑、助表面活性劑所形成的各向同性、熱力學(xué)穩(wěn)定體系[10]。微乳液可根據(jù)所要包埋的活性物特性來(lái)設(shè)計(jì)其組分和結(jié)構(gòu)，能夠極大地拓展植物精油的應(yīng)用。此外，因其具有粒徑小、可自發(fā)形成、制備簡(jiǎn)單、組分易得等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取M.EO，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀分析其組成；選擇在食品行業(yè)廣泛應(yīng)用的材料分別作為表面活性劑和助表面活性劑，在涼粉草精油微乳液（M.EO microemulsion，M.EO-ME）構(gòu)建前使用偽三元相圖來(lái)篩選合適的助表面活性劑、表面活性劑、表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比（Km）和混合表面活性劑與油相的質(zhì)量比（Smix）；通過(guò)黏度、電導(dǎo)率、亞甲基藍(lán)擴(kuò)散情況、粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）來(lái)表征微乳液的構(gòu)型變化和理化性質(zhì)；最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、過(guò)氧自由基清除能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）法以及人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞模型來(lái)比較M.EO和M.EO-ME的抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，以期為涼粉草資源的高值化開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)，為涼粉草精油的商業(yè)化應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼粉草（干制品）購(gòu)于武平盛達(dá)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司。

甘油、1,2-丙二醇、無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、正己烷上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）、DPPH、水溶性維生素E（Trolox）、2,7-二氯二氫熒光素二乙酯（dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸（2,2’-azobis(2-amidinopropane)-dihydrochloride，ABAP）、熒光素鈉 美國(guó)Sigma公司；人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（75 mmol/L、pH 7.4）、高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清 浙江天航生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

水蒸氣蒸餾裝置 佛山捷特輕工機(jī)械有限公司；7890A-5975C型GC-MS、DB-5ms氣相色譜毛細(xì)管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；DDS-11A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；NDJ-8S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSE納米粒度儀 英國(guó)Malvern公司；DU730分光光度計(jì) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Filter Max F5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular公司；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 涼粉草精油的提取

M.EO采用水蒸氣蒸餾法提取[12]：將涼粉草粗粉碎至長(zhǎng)度約3 cm，取120 kg粉碎后的涼粉草于水蒸氣蒸餾裝置中，按照料液比1∶10（m/V）加入1 200 kg水，保持微沸狀態(tài)蒸餾3 h。收集冷凝液上層精油粗提物（約20 L），分多次萃取粗提物，每次取1 L的粗提物用1.5 L的石油醚萃取，重復(fù)萃取2 次。收集萃取所得上層液體（有機(jī)相），加入無(wú)水硫酸鈉干燥30 min，過(guò)濾后將濾液45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚，得澄清透明的金黃色M.EO，密封于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析涼粉草精油的組分

GC-MS分析前，M.EO需用正己烷按照體積比1∶100稀釋。

氣相色譜條件：色譜柱：DB-5ms氣相色譜毛細(xì)管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱流速：1 mL/min；進(jìn)樣量0.2 μL；分流比30∶1；升溫程序：60 ℃保持3 min；3 ℃/min升溫至120 ℃；4 ℃/min升溫至180 ℃；15 ℃/min升溫至280 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度：280 ℃；電子轟擊離子源，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：33～450m/z；檢索譜庫(kù)：Nist08，最后用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.3.3 M.EO-ME的制備及偽三元相圖的繪制

首先將表面活性劑與助表面活性劑混合形成混合表面活性劑，兩者的質(zhì)量比為Km。以M.EO為油相，制備混合表面活性劑與M.EO質(zhì)量比（Smix）分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的混合油相，然后一邊攪拌一邊在混合油相中逐滴滴加去離子水，記錄體系達(dá)到臨界點(diǎn)（由澄清變渾濁）時(shí)加入去離子水的體積，根據(jù)已加入的混合表面活性劑和油相的質(zhì)量繪制偽三元相圖，分別以混合表面活性劑、油相、水相作為偽三元相圖的3 個(gè)頂點(diǎn)，根據(jù)油相、水相、混合表面活性劑在臨界點(diǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)確定該點(diǎn)在相圖中的位置，記錄臨界點(diǎn)在偽三元相圖上的位置，由臨界點(diǎn)圍成的區(qū)域?yàn)槲⑷閰^(qū)域，通過(guò)Originlab繪圖軟件計(jì)算微乳區(qū)域相對(duì)面積。

1.3.4 M.EO-ME的組成優(yōu)化和影響因素

1.3.4.1 助表面活性劑的種類對(duì)微乳液形成的影響

以吐溫80為表面活性劑，分別與無(wú)水乙醇、甘油、1,2-丙二醇以Km＝2∶1進(jìn)行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節(jié)的方法繪制偽三元相圖，比較各助表面活性劑的微乳區(qū)域相對(duì)面積。

1.3.4.2 表面活性劑的種類對(duì)微乳液形成的影響

以無(wú)水乙醇為助表面活性劑，分別與吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80以Km＝2∶1進(jìn)行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節(jié)的方法繪制偽三元相圖，比較各表面活性劑的微乳區(qū)域相對(duì)面積。

1.3.4.3Km對(duì)微乳液形成的影響

以吐溫60為表面活性劑，無(wú)水乙醇為助表面活性劑，兩者以Km分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1進(jìn)行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節(jié)的方法繪制偽三元相圖，比較各Km的微乳區(qū)域相對(duì)面積。

1.3.5 M.EO-ME的構(gòu)型分析

黏度和電導(dǎo)率的變化可以簡(jiǎn)單且直觀地反映微乳液的不同構(gòu)型間的轉(zhuǎn)變，因此被廣泛應(yīng)用于微乳體系的構(gòu)型表征[13]。此外，通過(guò)觀察親水性或親油性的染液在微乳體系中的擴(kuò)散情況，同樣可以直觀地表征微乳液的構(gòu)型轉(zhuǎn)變[14]。制備水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，以吐溫60為表面活性劑，無(wú)水乙醇為助表面活性劑，Km＝2∶1和Smix＝8∶2的微乳液。在25 ℃下，測(cè)定各體系的電導(dǎo)率和黏度，并在各體系中滴加2 滴水溶性染液亞甲基藍(lán)（1 g/L），觀察染液擴(kuò)散情況，分析微乳液的構(gòu)型變化。

1.3.6 M.EO-ME的理化性質(zhì)和稀釋穩(wěn)定性分析

參照1.3.5節(jié)方法測(cè)定M.EO-ME（Km＝2∶1、Smix＝8∶2、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝70%）的電導(dǎo)率和黏度，然后在25 ℃條件下，用100、200 倍體積的去離子水將M.EO-ME稀釋，使用Zetasizer Nano ZSE納米粒度儀測(cè)定其平均粒徑和PDI。

1.3.7 M.EO及其微乳液的抗氧化活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]測(cè)定M.EO及其微乳液的DPPH自由基清除能力。稱取一定量的DPPH粉末溶解于無(wú)水乙醇中配制成2 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液。DPPH儲(chǔ)備溶液在使用前用無(wú)水乙醇稀釋得到0.2 mmol/L DPPH工作液。取1 mL 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL M.EO及微乳液樣品（均以精油計(jì)）或5、15、20、25 μg/mL VC溶液，與等體積的DPPH工作液混合均勻。于25 ℃避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。DPPH自由基清除率按照公式（1）計(jì)算。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，采用Calcusyn軟件分別計(jì)算VC、M.EO和M.EO-ME的半數(shù)效應(yīng)劑量（median effective concentration，EC50），以VC EC50與樣品EC50的比為樣品的DPPH值/（μmol/g）。

式中：樣品與DPPH工作液的混合液吸光度為As；無(wú)水乙醇與樣品的混合液吸光度為A0；無(wú)水乙醇與DPPH工作液的混合液吸光度為空白對(duì)照Ac。

參考文獻(xiàn)[16]測(cè)定M.EO及其微乳液的ORAC。分別稱取Trolox和樣品，用PBS配制6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的Trolox溶液以及不同質(zhì)量濃度的樣品。在避光的環(huán)境下，分別在黑色96?孔板中加入20 μL/孔不同劑量的Trolox溶液或樣品，并加入200 μL 0.96 μmol/L熒光素鈉鹽，混合均勻。在37 ℃下孵育20 min后，每孔加入20 μL 119 mmol/L ABAP溶液。將黑色96?孔板放入多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，共35?個(gè)熒光循環(huán)。以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，ORAC由回歸方程計(jì)算得到，并以Trolox當(dāng)量表示，單位為μmol/mg。

參考文獻(xiàn)[17]測(cè)定M.EO及其微乳液的PSC。用PBS稀釋得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL的M.EO和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的M.EO-ME（以精油計(jì)）或1.0、2.4、3.2、4.8、6.3 μg/mL的VC溶液。黑色96?孔板中分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品或VC溶液。預(yù)先加入1 mmol/L KOH溶液使DCFH-DA水解5 min，然后向黑色96?孔板的每孔加入100 μL 13.26 μmol/L DCFH-DA和50 μL 200 mmol/L ABAP。將黑色96?孔板放入多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，共40 min。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，PSC以VC當(dāng)量表示，單位為μmol/g。

1.3.8 M.EO及其微乳液的細(xì)胞毒性和抗增殖活性測(cè)定

人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的培養(yǎng)基為含有10%（體積分?jǐn)?shù)）的胎牛血清、10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和1%（體積分?jǐn)?shù)）青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)[18]，采用亞甲基藍(lán)測(cè)定法評(píng)價(jià)M.EO及其微乳液的細(xì)胞毒性。先用培養(yǎng)基分別稀釋得到60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油質(zhì)量計(jì)）。按2.5h104個(gè)/孔將細(xì)胞接種在96?孔板上。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，以加入100 μL不含樣品的培養(yǎng)基為對(duì)照組，加入100 μL PBS作為空白組，繼續(xù)孵育24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔用100 μL PBS洗滌細(xì)胞，加入50 μL亞甲藍(lán)溶液（6 g/L）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。于培養(yǎng)箱中孵育1 h后，吸棄亞甲藍(lán)溶液，96?孔板用清水洗凈，拍干并向每孔加入100 μL乙醇-PBS-乙酸洗脫液（體積比為50∶48∶1），振蕩20 min。將96?孔板放入全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞毒性。

式中：As為樣品孔減去空白孔的吸光度；Ac為對(duì)照孔減去空白孔的吸光度。

參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行抗增殖活性評(píng)價(jià)。按1.5h104個(gè)/孔將細(xì)胞接種在96?孔板上，并在恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。移除培養(yǎng)基后，每孔分別加入100 μL質(zhì)量濃度60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或質(zhì)量濃度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油質(zhì)量計(jì)）。以加入100 μL不含樣品的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，加入100 μL PBS作為空白組。孵育48 h后，用前述細(xì)胞毒性的方法染色、讀板。細(xì)胞增殖率按照公式（3）計(jì)算。

式中：As為樣品孔減去空白孔的吸光度；Ac為對(duì)照孔減去空白孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有樣品均設(shè)置3?個(gè)平行，處理后的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2020軟件作圖，Sigmaplot 14.0軟件計(jì)算曲線下積分面積，采用Calcusyn 2.1軟件計(jì)算濃度效應(yīng)，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 M.EO的化學(xué)組分

從M.EO分離出42種組分，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，其中相對(duì)含量高于1%的組分有17種，占總峰面積的91.58%。由表1可知，M.EO中相對(duì)含量較高的組分有香樹烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、異石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛術(shù)烯（7.62%），這些組分主要為烯萜類化合物及其氧化物。

表1 M.EO揮發(fā)性組分中相對(duì)含量高于1%的組分Table 1 Volatile components of M.EO with relative content greater than 1%

有文獻(xiàn)報(bào)道，M.EO中的主要組分如香樹烯、β-石竹烯、異石竹烯和甲位葎草烯等具有較好的抗氧化、抗增殖活性[20-22]，因此可為其后續(xù)的活性研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 M.EO-ME的構(gòu)建和優(yōu)化

2.2.1 助表面活性劑對(duì)微乳液形成的影響

在微乳液形成過(guò)程中，助表面活性劑能夠嵌入到水-油界面中，促進(jìn)表面活性劑在體系中的分散，從而降低表面張力，提高水-油界面膜的流動(dòng)性和彈性，同時(shí)，它可以溶解在水相和油相中，起到調(diào)節(jié)兩相極性的作用[23]。從圖1可知，3種助表面活性劑形成的微乳區(qū)域相對(duì)面積由大到小依次為無(wú)水乙醇＞1,2-丙二醇＞甘油，隨著助表面活性劑羥基數(shù)量的增加，微乳區(qū)域相對(duì)面積減小。這可能是由于醇類分子體積的增加不利于水-油界面膜的彎曲，引起微乳結(jié)構(gòu)向液晶相轉(zhuǎn)變[24]。醇類分子在油相中的溶解性提高會(huì)抑制水相或油相的極性調(diào)節(jié)作用，從而更容易產(chǎn)生液晶相[25]。此外，甘油作為助表面活性劑時(shí)微乳區(qū)域相對(duì)面積最小，可能是因?yàn)楦视偷母唣ざ群偷土鲃?dòng)性導(dǎo)致其在水-油界面和水相中的穿透性降低[26]。因此，選擇無(wú)水乙醇作為助表面活性劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 助表面活性劑對(duì)微乳液形成的影響Fig. 1 Effect of co-surfactant on microemulsion fabrication

2.2.2 表面活性劑對(duì)微乳液形成的影響

由圖2可知，不同表面活性劑的微乳區(qū)域相對(duì)面積由大到小依次為吐溫60＞吐溫80＞吐溫40＞吐溫20。這一結(jié)果與表面活性劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同的吐溫系列表面活性劑，它們每一分子都有20?個(gè)環(huán)氧乙烷亞基，但疏水鏈的長(zhǎng)度、脂肪酸類型和酯化程度不同，吐溫20和吐溫40的疏水鏈長(zhǎng)分別為12和16，而吐溫60和吐溫80的疏水鏈長(zhǎng)為18，但酯化程度有所區(qū)別[27-28]。除了以上的因素外，表面活性劑與助表面活性劑、油相的親和性也會(huì)影響微乳液的形成能力和穩(wěn)定性[29]。因此，選擇吐溫60作為表面活性劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 表面活性劑對(duì)微乳液形成的影響Fig. 2 Effect of surfactant on microemulsion fabrication

2.2.3Km對(duì)微乳液形成的影響

如圖3所示，微乳區(qū)域相對(duì)面積隨著Km的增大而增大，Km為3∶1時(shí)，微乳區(qū)域相對(duì)面積達(dá)到最大值45.49%。當(dāng)Km為1∶2時(shí)微乳區(qū)域相對(duì)面積較小，可能是由于混合表面活性劑的乙醇含量較高，大部分的乙醇溶解于水相中，而沒(méi)有吸附在水-油界面膜上，這降低了界面膜的彈性，使微乳液穩(wěn)定性下降[30-31]。而Km為2∶1和3∶1時(shí)，體系中的表面活性劑含量較高，它們被吸附到界面膜上，提升了界面膜的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，因此微乳區(qū)域相對(duì)面積較大[30-31]。盡管更大的Km可得到更大的微乳區(qū)域相對(duì)面積，但過(guò)高的表面活性劑用量可能會(huì)帶來(lái)安全性問(wèn)題，Km為2∶1時(shí)微乳區(qū)域相對(duì)面積略小于3∶1時(shí)，且兩者都具有Smix＝9∶1和Smix＝8∶2兩條水無(wú)限稀釋線，為了穩(wěn)定增溶更多的M.EO，因此，選擇Km＝2∶1和Smix＝8∶2進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 Km對(duì)微乳液形成的影響Fig. 3 Effect of Km on microemulsion fabrication

2.3 M.EO-ME的構(gòu)型表征

圖4表示微乳液隨水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化下的電導(dǎo)率與黏度變化趨勢(shì)。電導(dǎo)率的變化可以揭示微乳液體系相轉(zhuǎn)變過(guò)程。在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～30%范圍內(nèi)，電導(dǎo)率隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而緩慢增加，非離子型表面活性劑與油相將少量的水包裹、隔離，小水滴間很少發(fā)生碰撞與接觸，因此電導(dǎo)率增加緩慢，微乳液為油包水（water in oil，W/O）型[32]。在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%～60%范圍內(nèi)，電導(dǎo)率隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而快速增加，此時(shí)小水滴開(kāi)始相互碰撞與接觸，導(dǎo)電通道逐步完善，因此電導(dǎo)率快速增加，微乳液為雙連續(xù)（B.C型）構(gòu)型[32]。在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%～90%范圍內(nèi)，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，電導(dǎo)率增加緩慢，至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最高值，隨后電導(dǎo)率逐漸下降，此時(shí)導(dǎo)電通道已經(jīng)完全形成，水的增加只會(huì)使電導(dǎo)率緩慢增加，且當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大時(shí)，會(huì)起到稀釋作用，從而出現(xiàn)電導(dǎo)率達(dá)到最高值后發(fā)生下降的現(xiàn)象[32]，微乳液為水包油（oil in water，O/W）型。

隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化而發(fā)生變化的黏度同樣可以表征微乳液的相轉(zhuǎn)變過(guò)程。與電導(dǎo)率類似的構(gòu)型變化規(guī)律可以在黏度的變化中觀察到，在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～30%范圍內(nèi)，黏度隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而逐步升高，微乳液為W/O型；在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%～60%范圍內(nèi)，黏度快速增加后又下降，形成鐘型曲線，微乳液為B.C型；在水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%～90%范圍內(nèi)，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，黏度緩慢下降，黏度處于較低的范圍，微乳液為O/W型。在B.C型區(qū)域得到最高的黏度，可能是因?yàn)樗?油的聚集和內(nèi)部聯(lián)結(jié)所致，而B.C型到O/W型轉(zhuǎn)變時(shí)，可觀察到黏度降至較低值，這表明了膠束結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[26]。

圖4 M.EO-ME電導(dǎo)率和黏度的變化曲線Fig. 4 Electrical conductivity and viscosity of M.EO-ME as a function of water content

圖5展示了水溶性染料亞甲基藍(lán)在微乳液中的擴(kuò)散情況。與電導(dǎo)率、黏度的變化規(guī)律類似，當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%的范圍內(nèi)，此時(shí)為W/O型微乳液，油相占據(jù)體系的主導(dǎo)，且密度比水小，因此亞甲基藍(lán)染料集中在底部；當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%～50%時(shí)，微乳液構(gòu)型向B.C型轉(zhuǎn)變，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，亞甲基藍(lán)染液在體系中的擴(kuò)散范圍逐漸增大；當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%及以上，B.C型微乳液轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型，水相開(kāi)始占據(jù)體系的主導(dǎo)，亞甲基藍(lán)染料擴(kuò)散得更充分、均勻。綜合以上結(jié)果以及微乳液構(gòu)建的目的，選擇水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的O/W型微乳液進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖5 亞甲基藍(lán)在不同水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)M.EO-ME中的擴(kuò)散情況Fig. 5 Methylene blue diffusion in M.EO-ME with different water contents

2.4 M.EO-ME的理化性質(zhì)和稀釋穩(wěn)定性

M.EO-ME的粒徑分布結(jié)果如圖6所示，M.EO-ME在稀釋前后均為單峰分布，對(duì)比原始狀態(tài)（即稀釋前），稀釋后的微乳液粒徑分布更集中。由表2可知，M.EO-ME電導(dǎo)率為260 μS/cm，具有較強(qiáng)的導(dǎo)電性；黏度較低，為8.19 mPags，說(shuō)明體系具有良好的流動(dòng)性。稀釋前的平均粒徑為（22.92±0.10）nm，PDI為0.36±0.00，說(shuō)明體系粒徑較小，粒徑分布較為均一。稀釋后平均粒徑與PDI都出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。由于微乳液的粒徑大小主要受界面組成和再分布影響，以上的結(jié)果可能是因?yàn)樗嗟脑黾?，引起助表面活性劑乙醇在水相中的溶解量增加，總界面面積減小，即兩相界面上的乙醇量有所減少，導(dǎo)致粒徑變小，粒徑分布更為均一[33]。此外，微乳液在經(jīng)100、200 倍稀釋后均未出現(xiàn)分層或絮凝等不穩(wěn)定的現(xiàn)象。因此，M.EO-ME具有較好的稀釋穩(wěn)定性。

圖6 稀釋前后的M.EO-ME的粒徑分布情況Fig. 6 Particle size distribution of M.EO-ME before and after dilution

表2 M.EO-ME的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical parameters of M.EO-ME

2.5 M.EO及其微乳液的抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如圖7A所示，M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除率與精油含量呈劑量依賴效應(yīng)，兩者的曲線類似，EC50分別為（1.43±0.07）、（1.27±0.11）mg/mL（以精油計(jì)）。由圖7B可知，M.EO經(jīng)微乳化處理后DPPH值略有提高，微乳化前后的DPPH值分別為（29.37±5.71）μmol/g和（33.08±7.50）μmol/g，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由此說(shuō)明，微乳液的構(gòu)建并沒(méi)有影響M.EO的抗氧化活性。

圖7 M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力（A）和DPPH值（B）Fig. 7 DPPH free radical-scavenging capacity (A) and DPPH values (B)of M.EO and M.EO-ME

2.5.2 氧自由基清除能力和過(guò)氧自由基清除能力

為了研究微乳液對(duì)脂溶性精油的水溶性環(huán)境改善作用，運(yùn)用水溶性的ORAC和PSC法以對(duì)比評(píng)價(jià)M.EO和M.EO-ME的抗氧化活性差異。

如圖8所示，M.EO和M.EO-ME的ORAC分別為（0.52±0.02）、（1.33±0.12）μmol/mg，PSC分別為（2.95±0.22）、（24.84±1.81）μmol/g。綜合ORAC和PSC結(jié)果可知，微乳液ORAC和PSC分別顯著提升為M.EO的2.6 倍和8.4 倍（P＜0.05），推測(cè)微乳液通過(guò)改善M.EO的水溶性，從而提高其在水溶性體系中的抗氧化活性。

圖8 M.EO和M.EO-ME的ORAC（A）和PSC（B）Fig. 8 ORAC (A) and PSC (B) of M.EO and M.EO-ME

ORAC和PSC方法采用更具生物學(xué)相關(guān)性的ABAP作為反應(yīng)的自由基引發(fā)劑，能夠更好地評(píng)價(jià)抗氧化活性物對(duì)機(jī)體由氧自由基和過(guò)氧自由基引發(fā)的損傷的抑制效果，為M.EO-ME作為保健食品、藥物以及日化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)[34-35]。

2.6 M.EO和M.EO-ME對(duì)A375細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗增殖活性

M.EO和M.EO-ME對(duì)A375細(xì)胞毒性和抗增殖活性如圖9所示。對(duì)比對(duì)照組，M.EO和M.EO-ME的抗增殖活性呈劑量依賴關(guān)系。M.EO質(zhì)量濃度為60～360 μg/mL時(shí)，細(xì)胞毒性最大為（7.26±1.46）%，低于10%，表現(xiàn)出極低的毒性，細(xì)胞增殖抑制率（100%－細(xì)胞增殖率）最大達(dá)（60.05±2.50）%。M.EO-ME質(zhì)量濃度為10～70 μg/mL時(shí)，細(xì)胞毒性最大為（9.43±3.65）%，細(xì)胞增殖抑制率最大達(dá)（59.51±1.15）%，同樣在極小的毒性下表現(xiàn)出較好的抗增殖活性。本研究引入選擇指數(shù)（selective index，SI）以評(píng)價(jià)M.EO和M.EO-ME的安全性，SI是半數(shù)細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度（concentration cytotoxicity 50%，CC50）和抗增殖活性EC50的比值，用來(lái)反映藥物的安全性，若SI大于2，則說(shuō)明抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，反之則主要由細(xì)胞毒性作用引起[36]。M.EO和M.EO-ME的EC50分別為（257.10±14.59）μg/mL和（52.43±3.68）μg/mL（以精油計(jì)），M.EO-ME的EC50僅為M.EO的約1/5；兩者的CC50均未能得到確切數(shù)值，分別大于600 μg/mL和大于100 μg/mL（以精油計(jì)）；即SI分別大于2.33和大于1.92，根據(jù)兩者的SI，均可說(shuō)明它們的抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，且M.EO經(jīng)微乳液包埋后，在毒性沒(méi)有明顯增大的情況下，其抗增殖效果有極大的提升，這可能是因?yàn)槲⑷橐焊纳屏薓.EO的水溶性，以及表面活性劑的存在和其極小的粒徑有助于M.EO透過(guò)細(xì)胞膜發(fā)揮活性作用[37-38]。

圖9 M.EO（A）和M.EO-ME（B）對(duì)A375細(xì)胞毒性和抗增殖活性Fig. 9 Cytotoxicity and anti-proliferative activity of M.EO (A) and M.EO-ME (B) against A375 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用水蒸氣蒸餾法提取得到M.EO，其主要組分經(jīng)GC-MS分析確定為香樹烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、異石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛術(shù)烯（7.62%）。以M.EO為油相，運(yùn)用偽三元相圖篩選確定吐溫60為表面活性劑，無(wú)水乙醇為助表面活性劑，Km＝2∶1，Smix＝8∶2的微乳液。微乳液經(jīng)100、200 倍水稀釋仍保持穩(wěn)定。最后，對(duì)比研究M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力、ORAC、PSC和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)微乳液在M.EO具有較好的抗氧化和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的基礎(chǔ)上，顯著提高了其ORAC、PSC以及抗腫瘤細(xì)胞增殖活性（P＜0.05）。本研究為涼粉草資源的高值化開(kāi)發(fā)與利用提供了新的思路，為M.EO在保健食品、藥品和日化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論參考。關(guān)于M.EO的抗增殖機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。