田文杰，王丹丹，王圣楠，馬月輝，蔣 琳，宋子儀

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

鋅指BED結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白6(zinc finger BED domain-containing protein 6,ZBED6)是近些年發(fā)現(xiàn)的胎盤類哺乳動(dòng)物特有、序列高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[1]。在家豬體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)基因內(nèi)含子3發(fā)生了G→A的突變，破壞了ZBED6對(duì)IGF2表達(dá)量的抑制，因此家豬中IGF2基因表達(dá)量增高，從而影響了內(nèi)臟器官、肌肉及脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。研究顯示，ZBED6基因編輯巴馬香豬和兩廣小花豬的IGF2基因表達(dá)量上調(diào)，產(chǎn)肉量增多[4-6]；ZBED6基因敲除小鼠IGF2基因表達(dá)量升高，肌肉增多[7]；ZBED6基因可抑制黃牛IGF2基因表達(dá)及肌肉發(fā)育[4-5]；ZBED6基因的遺傳變異與綿羊眼肌面積、尾脂重、背部肌肉厚及背最長(zhǎng)肌重等主要胴體性狀顯著相關(guān)[6]；在小鼠和牛肌原細(xì)胞中沉默ZBED6基因，結(jié)果顯示IGF2基因高表達(dá)，促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化[8-9]，以上研究均說(shuō)明了ZBED6-IGF2軸對(duì)肌肉發(fā)育的重要作用。

目前，ZBED6基因在豬上的研究主要集中于生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，對(duì)于豬腎臟代謝作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Markljung等[1]對(duì)ZBED6基因KO小鼠腎臟轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，差異基因主要集中于磷酸化等代謝通路。Younis等[7]利用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)對(duì)小鼠C2C12細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在ZBED6約1 200個(gè)潛在靶基因(包含IGF2基因)中，有約22%的靶基因編碼其他各種轉(zhuǎn)錄因子，由此推測(cè)除生長(zhǎng)發(fā)育外，ZBED6可能具有其他復(fù)雜的生理功能。

本研究以前期通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建成功的ZBED6 KO巴馬香豬[10]與WT巴馬香豬為研究對(duì)象，采集腎臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選在ZBED6 KO和WT巴馬香豬腎臟組織中差異表達(dá)基因并分析相關(guān)功能，以期為進(jìn)一步揭示ZBED6基因的分子調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)豬選自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所大興豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地，利用CRISPR/Cas9技術(shù)完成ZBED6基因敲除。選擇8月齡ZBED6基因敲除雌性巴馬香豬(編號(hào)為1、3、6)和野生型對(duì)照同性別巴馬香豬(編號(hào)為2、4、5)各3頭屠宰，采集腎臟(ZBED6 KO：腎臟1、腎臟3、腎臟6；WT：腎臟2、腎臟4、腎臟5)，迅速投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

RNAsimple總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；TruSeq試劑盒購(gòu)自Illumina公司。Agilent 2100生物分析儀和ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x均購(gòu)自ABI公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ZBED6基因敲除對(duì)豬腎臟組織中IGF2基因表達(dá)量的影響

使用RNAsimple總RNA提取試劑盒提取腎臟組織總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，質(zhì)量合格的RNA樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用RT-PCR試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，使用Primer Premier 5.0軟件選擇目的基因CDS區(qū)來(lái)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。引物均由華大基因有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O 7 μL，SYBR Green Mix 10 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物信息

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

1.4.1 RNA-Seq測(cè)序 將RNA樣品(濃度>100 ng/μL，總量>2.0 μg，且RIN值>8.0)送至北京貝瑞和康生物科技股份有限公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序。使用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)上述樣品進(jìn)行讀長(zhǎng)為150 bp的雙末端測(cè)序。

1.4.2 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控 采用FastQC對(duì)下機(jī)后數(shù)據(jù)(raw reads)質(zhì)量進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)；使用fastp軟件截去測(cè)序數(shù)據(jù)的測(cè)序接頭和低質(zhì)量片段，從而獲得高質(zhì)量的clean reads。具體操作為：去除含有索引接頭的reads；去除低質(zhì)量的reads(包含N的比例>10%的reads和低質(zhì)量堿基QPhred值≤10的堿基數(shù)占總堿基數(shù)量50%以上的reads)；去除過(guò)濾后長(zhǎng)度<25 bp的reads。

1.4.3 clean reads分析 參考基因組和注釋文件分別采用來(lái)自Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)的Susscrofa11.1和gtf100(https:∥asia.ensembl.org/index.html)。通過(guò)軟件TopHat、Cufflink、Cuffmerge和Cuffdiff對(duì)clean data分別進(jìn)行參考基因組比對(duì)、表達(dá)量的量化、轉(zhuǎn)錄本組裝及差異表達(dá)基因分析；用FDR法對(duì)P值進(jìn)行多重校正得到調(diào)整后P值，差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05和log2|FoldChange|>2。

1.5 差異表達(dá)基因的層次聚類和KEGG通路富集分析

通過(guò)R包繪制火山圖及熱圖，顯示差異表達(dá)基因的分布及在ZBED6 KO和WT豬腎臟中的表達(dá)；根據(jù)檢測(cè)到的所有表達(dá)基因的FPKM值，對(duì)6個(gè)腎臟樣品進(jìn)行主成分分析(PCA)。檢測(cè)樣品相關(guān)性；對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析(https:∥biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)，根據(jù)Fold-enrichment和調(diào)整后P值來(lái)篩選ZBED6潛在的互作基因。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果隨機(jī)選取7個(gè)差異表達(dá)基因(表1)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，方法同1.3。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

組間采用t檢驗(yàn)分析差異性，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，利用GraphPad軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGF2基因表達(dá)量

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGF2基因在ZBED6 KO和WT豬腎臟組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，敲除ZBED6基因后，豬腎臟中IGF2基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),表明ZBED6基因能夠抑制豬腎臟IGF2基因的表達(dá)。

*，差異顯著(P<0.05)，**，差異極顯著(P<0.01)。圖6同*，Significant difference(P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.6圖1 敲除ZBED6基因后豬腎臟中IGF2基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of IGF2 gene in porcine kidney after ZBED6 gene knockout

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估及比對(duì)

對(duì)ZBED6 KO和WT豬腎臟組織總RNA利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，6個(gè)樣品測(cè)序共獲得78 G數(shù)據(jù)量，各樣本質(zhì)控率和Q30數(shù)據(jù)均在90%以上，比對(duì)率在87%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于下一步生物信息學(xué)分析。

2.3 差異表達(dá)基因分析

在腎臟組織中利用RNA-Seq測(cè)序共鑒定到25 213個(gè)基因，與WT豬相比，ZBED6 KO豬中共篩選到299個(gè)差異表達(dá)基因，其中103個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，196個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖2)，IGF2基因同樣在ZBED6 KO豬腎臟中上調(diào)表達(dá)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。用熱圖展示差異表達(dá)基因在所有樣品中表達(dá)量的分布情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，2組樣品組內(nèi)均一性較好，但ZBED6 KO和WT豬腎臟中基因表達(dá)量存在明顯差異。

根據(jù)所有基因表達(dá)量FPKM值進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，WT和ZBED6 KO豬腎臟中表達(dá)模式組內(nèi)相似，但組間截然不同，證明采樣和測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集在視黃醇代謝、化學(xué)致癌、甲流、藥物代謝、補(bǔ)體和凝聚級(jí)聯(lián)6條通路中，大多數(shù)均與代謝活動(dòng)相關(guān)(圖5)，其整體通路結(jié)果與腎臟代謝的功能相符。KEGG通路富集分析最顯著的通路為視黃醇代謝通路，其中經(jīng)典的生物代謝關(guān)鍵酶CYP1A1基因同時(shí)被富集在視黃醇和細(xì)胞色素P450對(duì)外源性藥物兩條代謝通路中，說(shuō)明ZBED6基因敲除對(duì)巴馬香豬腎臟組織代謝活動(dòng)具有重要調(diào)控作用。

2.5 差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇7個(gè)差異表達(dá)基因CYP2C42、AOX1、RDH16、CYP2A19、CYP26B1、CYP1A1和RDH5，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，與WT豬相比，ZBED6 KO豬腎臟中CYP2C42、CYP2A19、RDH16、CYP1A1和RDH5基因表達(dá)量極顯著或顯著下調(diào)(P<0.01；P<0.05)，AOX1和CYP26B1基因表達(dá)量極顯著或顯著上調(diào)(P<0.01；P<0.05)，與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果相一致，證實(shí)了RNA-Seq測(cè)序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和比對(duì)分析

橫虛線為P-value為0.05的閾值；橫虛線往上右邊表示上調(diào)基因(103)，往上左邊表示下調(diào)基因(196)；往下表示非顯著差異表達(dá)基因Horizontal dotted line was the threshold of P-value=0.05 in the diagram；Above the horizontaldashed line，right represents up-regulated genes(103),left represents down-regulated genes(196)，below the horizontal dotted line represents non-significantly differentially expressed genes圖2 差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes

3 討 論

近年來(lái)，利用分子生物技術(shù)研究基因功能及調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為主要途徑。ZBED6是2009年發(fā)現(xiàn)并命名的轉(zhuǎn)錄因子，其序列在多種胎盤類哺乳動(dòng)物中高度保守[1]。研究發(fā)現(xiàn)，ZBED6基因除影響肌肉發(fā)育外，在調(diào)控小鼠糖脂代謝[11-13]、腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育[14]等方面也發(fā)揮著重要作用。Younis等[7]利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)ZBED6基因敲除(ZBED6 KO)小鼠腎臟組織分析發(fā)現(xiàn)，其差異表達(dá)基因主要富集在氧化磷酸化、運(yùn)輸活動(dòng)等與代謝相關(guān)通路中，表明ZBED6基因敲除除能夠促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)外，對(duì)小鼠腎臟代謝反應(yīng)同樣具有重要作用。然而，關(guān)于ZBED6基因?qū)ωi腎臟代謝調(diào)控的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，ZBED6基因敲除后豬腎臟組織中IGF2基因表達(dá)量顯著上調(diào)；RNA-Seq分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZBED6 KO豬腎臟組織中表達(dá)上調(diào)的103個(gè)基因中也包含IGF2基因，與Younis等[7]結(jié)果相一致，說(shuō)明ZBED6同樣能夠抑制豬腎臟中IGF2基因的表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ZBED6基因還可通過(guò)影響胰腺β細(xì)胞功能、胰島素產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)控糖脂代謝[11-13]。本研究中，差異表達(dá)基因顯著富集在6條與代謝相關(guān)的通路上，分別為視黃醇代謝、化學(xué)致癌、甲流、 藥物代謝、補(bǔ)體和凝聚級(jí)聯(lián)。

圖3 差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Heat map of differentially expressed genes

圖4 主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis map

提示在豬中ZBED6基因除通過(guò)抑制IGF2基因而影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育外，可能同樣對(duì)腎臟代謝發(fā)揮著重要作用。KEGG通路富集分析中最顯著的通路為視黃醇代謝通路，視黃醇又稱維生素A，是多種生物過(guò)程必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，包括視覺(jué)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[15-16]。腎臟是視黃醇一個(gè)重要的儲(chǔ)存器官[17]，通過(guò)其代謝功能維持視黃醇穩(wěn)態(tài)和運(yùn)轉(zhuǎn)[18-19]。視黃醇利用乙醇脫氫酶(ADH)[20]、短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)[21]、醛酮基還原酶(AKR)[22]和醛脫氫酶 (ALDH)[23]這4個(gè)家族成員代謝轉(zhuǎn)化為視黃酸(RA)進(jìn)而發(fā)揮作用。因此，視黃醇代謝是腎臟組織主要的代謝功能，為ZBED6基因調(diào)控豬腎臟代謝提供了有力支撐。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

圖6 7個(gè)差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證Fig.6 Real-time quantitative PCR verification of 7 differentially expressed genes

聚乙二醇化姜黃素衍生物Curc-mPEG454通過(guò)上調(diào)醛氧化酶1(AOX1)、下調(diào)細(xì)胞色素P45026A1(CYP26A1)和細(xì)胞色素P45026B1 (CYP26B1)，從而恢復(fù)肝臟RA水平。

CYP26B1作為視黃酸清除酶，通過(guò)氧化代謝來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞中視黃酸的濃度[24]，有助于哺乳動(dòng)物和其他脊索動(dòng)物的視黃酸代謝和體內(nèi)平衡。研究表明，小鼠CYP26B1基因全身敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，而對(duì)出生后小鼠敲除CYP26B1基因雖不致死，但表現(xiàn)出壽命縮短、脂肪萎縮及視黃酸濃度增加[25]。這些結(jié)果證明，CYP26B1在視黃酸代謝中發(fā)揮著重要的作用[26]。本研究中，ZBED6 KO豬腎臟中AOX1和CYP26B1基因均顯著富集到視黃醇代謝通路上，轉(zhuǎn)錄組分析與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AOX1和CYP26B1基因顯著上調(diào)，推測(cè)ZBED6基因可能通過(guò)同時(shí)上調(diào)AOX1和CYP26B1基因來(lái)調(diào)控腎臟組織中視黃酸代謝的動(dòng)態(tài)平衡。

視黃醇能夠合成視黃醛，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為視黃酸，轉(zhuǎn)化后的視黃酸會(huì)與其靶蛋白進(jìn)行結(jié)合，從而發(fā)揮作用。視黃醇脫氫酶5、16(RDH5、RDH16)都是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與視黃醇代謝高度相關(guān)[27]，其相關(guān)途徑包括脂溶性維生素代謝和視黃酸生物合成。研究證明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)調(diào)控RDH16的從頭合成并影響了視黃醇代謝途徑[28]。RDH5基因作為短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族的成員，具有催化視黃醇合成視黃醛的功能[29]。RDH5基因敲除小鼠可以存活，但在黑暗環(huán)境中的反應(yīng)比較遲緩，說(shuō)明RDH5基因的缺失導(dǎo)致小鼠體內(nèi)視黃醇轉(zhuǎn)化視黃醛減少，視覺(jué)能力減緩的性狀一致[30-31]。此外，RDH5基因突變會(huì)導(dǎo)致人類患有夜盲癥，證明RDH5基因具有產(chǎn)生視黃醛的功能[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，RDH5和RDH16基因的表達(dá)量在ZBED6 KO豬腎臟組織中顯著下調(diào)，提示ZBED6 KO可能通過(guò)下調(diào)RDH5和RDH16基因表達(dá)減少視黃醇轉(zhuǎn)化為視黃醛。 研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P4501A1 (CYP1A1)作為生物代謝的關(guān)鍵酶之一，可以將小鼠和人的視黃醛催化為視黃酸[33-34]，CYP1A1的誘導(dǎo)劑和抑制劑也會(huì)影響小鼠上皮組織中視黃酸的合成[35]。CYP1A1被富集在細(xì)胞色素P450對(duì)外源性藥物的代謝作用中，早期研究發(fā)現(xiàn)，CYP1A1影響一些酶的活性，進(jìn)而影響大鼠肝臟和腎臟對(duì)藥物代謝的效率[36]。本研究中，CYP1A1基因同時(shí)被富集在視黃醇代謝和細(xì)胞色素P450對(duì)外源性藥物的代謝作用2條通路中，CYP1A1基因表達(dá)量在ZBED6 KO豬腎臟組織中顯著下調(diào)。 因此，ZBED6基因可能通過(guò)下調(diào)RDH5、RDH16和CYP1A1基因表達(dá)，同時(shí)上調(diào)AOX1與CYP26B1基因的表達(dá)在視黃醇-視黃醛-視黃酸的體內(nèi)代謝和動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控中發(fā)揮重要功能。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，ZBED6基因敲除顯著上調(diào)了豬腎臟組織中IGF2基因表達(dá)量，共篩選到包括IGF2基因在內(nèi)的103個(gè)上調(diào)基因和196個(gè)下調(diào)基因，CYP2C42、CYP1A1、CYP2A19、RDH16、RDH5、CYP26B1及AOX1基因是ZBED6基因調(diào)控巴馬香豬腎臟視黃醇代謝的重要靶基因。