薛 露，降建新

(南通大學第五附屬醫(yī)院，江蘇 泰州 215300；泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 215300)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應，多伴有器官灌注不足，最終導致器官功能障礙，威脅患者生命安全.10%～20%的膿毒癥患者入院48 h內可發(fā)展為膿毒性休克，死亡率超過40%[1]，因此，探索新的治療靶點對改善患者預后具有重要意義.相關研究[2]顯示：免疫功能紊亂貫穿膿毒癥的整個病程，在病情發(fā)展中起到關鍵作用.免疫細胞凋亡是人體免疫功能紊亂的主要原因，膿毒癥免疫調節(jié)治療是目前研究的熱點之一[3].隨著近年來基因組學的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(miRNA)在膿毒癥中存在異常表達，其中部分miRNA能夠介導膿毒癥的免疫細胞調控，進而影響炎癥因子的分泌[4].有研究[5]顯示：miR-30a-5p基因敲除的小鼠體內CD4+T細胞功能有明顯的增強，且能夠刺激T細胞向Th1亞群分化，提示miR-30a-5p基因能夠參與調控T淋巴細胞.但目前miR-30a-5p在膿毒癥患者中表達及作用的研究仍十分少見.因此，本研究主要探討膿毒癥患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達及對淋巴細胞凋亡和血清炎癥因子分泌的影響，旨為膿毒癥患者的臨床診治提供新的思路.

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年3月—2020年5月南通大學第五附屬醫(yī)院收治的膿毒癥患者96例，根據患者28 d的生存情況將患者分為存活組65例、死亡組31例.存活組男36例，女29例；年齡28～56歲，平均(47.05±8.51)歲.死亡組男18例，女13例；年齡30～58歲，平均(47.84±7.90)歲.性別、年齡在兩組患者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性.本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準(LDK-2019014).

入選標準：符合歐洲危重醫(yī)學會(ESICM)頒布的膿毒癥診斷標準[6]；年齡>18歲，能夠正常溝通交流.

排除標準：合并惡性腫瘤、人乳頭瘤病毒感染、骨髓移植的患者；近3個月有免疫抑制劑治療史的患者.

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒(天津卡梅德生物科技有限公司)；鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人PARP-1單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠IgG(北京沃卡威生物有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(山東德諾生物科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 標本采集與處理

抽取兩組患者的外周靜脈血10 mL，取其中7 mL用于分離淋巴細胞，加入淋巴細胞分離液，5 000 r/min離心20 min，收集白色淋巴細胞層，加入生理鹽水混合均勻，5 000 r/min離心10 min，棄去上清，收集離心管底細胞(淋巴細胞).取另外的3 mL外周靜脈血，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存待測.

1.3.2 RT-PCR法檢測淋巴細胞中miR-30a-5p及Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2 mRNA水平

使用RNA提取試劑盒獲得兩組患者外周血淋巴細胞總RNA，應用分光光度法測定RNA濃度，取適量RNA，反轉錄得到互補DNA.PCR擴增引物由上海信帆生物科技有限公司設計合成.miR-30a-5p正向引物：5′-TTTCATTATTACAGGG CAGCGGT-3′，反向引物：5′-GGCACTCATTATTACGCGGCAA-3′；Caspase-3正向引物：5′-GCGTGCCGTTGTGTAGAG TTT-3′，反向引物：5′-ACTGCTAATTCGTCCCCAAT G-3′；PARP-1正向引物：5′-GCACGTAGTAGTTCCC TTGTGG-3′，反向引物：5′-CGTAAGACCTGTATTCT GTCCTG-3′；Bax正向引物：5′-CTTAACGGCTGAGG TGCTGTG-3′，反向引物：5′-GTCGAACAGTTTATGT CGACA-3′；Bcl-2正向引物：5′-ATACACGACGGC TTCGCTCGC-3′，反向引物：5′-ATACACGACGGCTT CGCTCAA-3′.內參U6正向引物：5′-GCAACTGAG GCTGGAAGTCGG-3′，反向引物：5′-CCAGGTAGGT ACTGTTGAAAC-3′.PCR反應設定條件：94 ℃預變性1 min，95 ℃變性50 s，57 ℃復性30 s，共40個循環(huán)，72 ℃延伸1 min.循環(huán)數(shù)法計算目的基因表達水平.

1.3.3 Western blot法檢測Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

分別提取兩組患者外周血淋巴細胞總蛋白，蛋白定量后電泳分離目標蛋白，濕法轉膜后封閉，滴加鼠抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人PARP-1單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人Bax單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫反應2 h，應用E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析各條帶灰度值.

1.3.4 酶聯(lián)免疫法檢測血清炎癥因子水平

采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測兩組患者血清C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-10、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達水平，操作嚴格按試劑盒說明書進行.

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 兩組患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達水平

死亡組患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p mRNA相對表達量為2.64±0.47，明顯高于存活組的1.31±0.29，差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.237，P=0.011).

2.2 兩組患者外周血淋巴細胞中凋亡相關蛋白的mRNA和蛋白表達水平

死亡組患者外周血淋巴細胞中Caspase-3、PARP-1、Bax 的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于存活組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；死亡組患者外周血淋巴細胞中Bcl-2的 mRNA和蛋白表達水平明顯低于存活組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).見表1、圖1.

表1 兩組患者外周血淋巴細胞中Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2的 mRNA和蛋白相對表達量Tab.1 Relative expressions of Caspase-3，PARP-1，Bax，Bcl-2 mRNA and protein in peripheral blood lymphocytes between the two groups

圖1 Western blot法檢測兩組患者外周血淋巴細胞中凋亡相關蛋白表達情況Fig.1 Expression of apoptosis related proteins in peripheral blood lymphocytes of the two groups detected by Western blot

2.3 兩組患者血清炎癥因子表達水平

死亡組患者血清促炎因子C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度明顯高于存活組，抑制炎癥因子白細胞介素-10濃度明顯低于存活組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).見表2.

表2 兩組患者血清炎癥因子表達水平Tab.2 Expression levels of serum inflammatory factor between the two groups

2.4 miR-30a-5p與凋亡相關蛋白表達的相關性分析

Pearson相關性分析顯示：外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達水平與Caspase-3、PARP-1、Bax蛋白表達水平呈正相關，與Bcl-2蛋白表達水平呈負相關.見表3.

表3 外周血淋巴細胞中miR-30a-5p與凋亡相關蛋白表達的相關性分析Tab.3 Correlation analysis between miR-30a-5p and apoptosis related protein expression in peripheral blood lymphocytes

2.5 miR-30a-5p與血清炎癥因子表達的相關性分析

Pearson相關性分析顯示：外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達水平與血清C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度呈正相關，與血清白細胞介素-10濃度呈負相關.見表4.

表4 外周血淋巴細胞中miR-30a-5p與血清炎癥因子表達的相關性分析Tab.4 Correlation analysis between miR-30a-5p in peripheral blood lymphocytes and serum inflammatory factor expression

3 討 論

膿毒癥是臨床常見的嚴重感染性疾病，會引發(fā)多臟器功能障礙，死亡率高，其發(fā)病機制復雜，包括細胞凋亡、炎癥反應及線粒體功能障礙等[7].相關研究[8]顯示：免疫細胞凋亡通過介導免疫系統(tǒng)功能紊亂參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展.當細胞凋亡異常時，人體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，通過激活Caspase-3、Bax和抑制Bcl-2而啟動細胞凋亡程序[9].膿毒癥患者免疫細胞損傷和免疫功能障礙的發(fā)病機制是近年來的研究熱點之一.研究[10]顯示：膿毒癥會加速T淋巴細胞凋亡，T淋巴細胞低反應性與其凋亡水平密切相關；膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)與淋巴細胞凋亡有關.近年來隨著對miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)免疫細胞受多種miRNA的調控，其中下調miR-30a-5p能夠抑制急性肺損傷大鼠模型的肺泡上皮細胞凋亡[11]；上調miR-30a-5p能夠促進脂多糖誘導的細胞凋亡、炎癥反應以及線粒體損傷[12].但關于miR-30a-5p在膿毒癥患者中的表達及相關作用的研究仍十分少見.探討miR-30a-5p表達對膿毒癥發(fā)展的影響能夠為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點、改善患者預后提供依據.

本研究結果顯示：死亡組患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p mRNA相對表達量明顯高于存活組，Caspase-3、PARP-1、Bax 的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于存活組，Bcl-2的 mRNA和蛋白表達水平明顯低于存活組.近年來的研究[13]顯示：外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達水平與Caspase-3、PARP-1、Bax蛋白表達水平呈正相關，與Bcl-2蛋白表達水平呈負相關.Caspase家族蛋白活化是細胞凋亡的主要生物學特征，其中Caspase-3能夠破壞細胞的正常功能，激活凋亡信號傳導通路，促進細胞凋亡.Caspase-3被活化后會增加PARP-1裂解片段的表達，相關研究[14]顯示：脊髓損傷的大鼠模型中可見神經細胞凋亡，且合并PARP-1裂解片段高表達，與Caspase-3表達水平呈正相關.Bax與抑制凋亡蛋白Bcl-2能夠結合成凋亡二聚體，大量分泌凋亡誘導因子，與Caspase家族蛋白發(fā)生級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡[15].結合本研究結果可推測，膿毒癥患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p高表達可激活Caspase-3、PARP-1裂解片段和Bax，抑制Bcl-2，進而促進淋巴細胞凋亡，加速病情進展.

miR-30a-5p位于6號染色體1區(qū)，多個轉錄因子調控其表達.相關研究[15-16]顯示：miR-30a-5p參與免疫炎癥反應、血細胞生成等過程.C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎因子能夠促進免疫細胞生長、分化、歸巢至感染部位，清除細胞中的病原體；同時還能夠增強淋巴細胞對感染部位的浸潤以及白細胞表達黏附因子，提升免疫細胞浸潤水平[17].白細胞介素-10、白細胞介素-1Ra等抗炎因子能夠抑制腫瘤壞死因子α、白細胞介素-8等細胞因子的促炎作用，控制炎癥反應[18].本研究結果顯示：死亡組患者血清C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度明顯高于存活組，白細胞介素-10濃度明顯低于存活組；外周血淋巴細胞中miR-30a-5p表達水平與血清C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度呈正相關，與血清白細胞介素-10濃度呈負相關.可推測miR-30a-5p通過靶向作用于某個信號通路，激活膿毒癥患者體內炎癥反應，使其病情加重，但具體信號通路仍需要進一步深入研究.

綜上所述，膿毒癥患者外周血淋巴細胞中miR-30a-5p高表達提示不良預后；其通過加速淋巴細胞凋亡以及上調促炎因子C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達、抑制抗炎因子白細胞介素-10表達來影響免疫狀態(tài)，加重患者病情.