林允斌 李小霞 盧愛薇 卓德祥 朱虹 羅碧琚 陳龍 肖首浩

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，不論在病死率還是在惡性腫瘤死因構(gòu)成比中，肺癌都呈現(xiàn)逐步上升的趨勢[1]。按組織學(xué)分類，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占肺癌總數(shù)的80%[1]，且惡性程度較高。目前，NSCLC的治療方式主要包括手術(shù)治療、放療、化療以及分子靶向治療[2]，手術(shù)切除是目前肺癌較為常見的常規(guī)治療方法，然而對于晚期無法手術(shù)的NSCLC患者，以鉑類為基礎(chǔ)的化療仍然是治療的主流，盡管鉑類化療和靶向治療顯示出優(yōu)越的治療效果，但二者存在耐藥或者基因突變陰性等治療的局限性，且非小細(xì)胞性肺癌的5年生存率仍僅為4%～17%，肺癌的早期診斷和治療是臨床醫(yī)生和科研工作者共同面對的難題，尤其是難治性NSCLC患者的新療法仍亟待挖掘[3-4]。近幾年來，繼腫瘤分子靶向治療之后，腫瘤的免疫治療成為新的熱點(diǎn)，其中以程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）為免疫抑制點(diǎn)的免疫治療藥物在臨床藥物試驗(yàn)中顯示了較好的療效和耐受性[5-6]，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的PD-L1和免疫T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，通過阻斷PD-1/PD-L1通路，可恢復(fù)機(jī)體的抗腫瘤免疫，達(dá)到腫瘤免疫治療的效果[7]。Wnt信號通路廣泛參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤耐藥[8-10]。近年研究表明，Wnt信號通路參與了腫瘤的免疫逃逸，從而減弱了免疫治療的效果[11-12]。國內(nèi)外已經(jīng)對腫瘤中多種信號通路調(diào)控PD-L1的表達(dá)做了詳細(xì)的研究，Lorenzo等[13]的研究表明，在三陰性乳腺癌中，Wnt信號通路參與了PD-L1的表達(dá)調(diào)控，但是在NSCLC中Wnt信號通路對PD-L1的調(diào)控尚無報(bào)道。本研究旨在通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化的方法研究非小細(xì)胞癌中β-catenin和PD-L1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析二者之間表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，探討NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)進(jìn)而影響NSCLC的免疫調(diào)節(jié)的可能性，并為PD-L1抗體在NSCLC的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床腫瘤標(biāo)本

本研究NSCLC腫瘤組織標(biāo)本來源于2016年1月—2019年1月在三明市第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的NSCLC患者。手術(shù)離體腫瘤組織標(biāo)本和對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本使用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。本研究經(jīng)三明市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）

組織總RNA提取按照Trizol（Invitrogen）試劑說明進(jìn)行?？俁NA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。引物如下：β-catenin（up）5′ -CTGCGAGGAGAAGATGGTTA-3′，β-catenin（down）5′ -CTTTGCACAAGTCTCCCAAC-3′；PD-L1（up）5'-CTGCATGATCAGCTATGGTGGTG-3'，PD-L1（down）5'-CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA-3'；GAPDH（up）5′-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC-3′?；虻谋磉_(dá)變化用2-ΔΔCt法計(jì)算，GAPDH為內(nèi)參。

1.3 免疫組化

將甲醛固定的石蠟切片先后經(jīng)二甲苯脫蠟、分級酒精水化，微波中檔修復(fù)10 min，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶15 min，5%正常血清37℃封閉30 min，一抗4℃孵育過夜（PD-L1抗體1∶25稀釋，β-catenin抗體1∶3 000稀釋），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育30 min，使用新鮮配制的DAB顯色，顯微鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或細(xì)胞核可見棕黃色顆粒為陽性，400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比率，≥10%為陽性，＜10%為陰性；染色強(qiáng)度按陰性、弱、中和強(qiáng)染色評為0～3分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)和計(jì)量資料分別用率（%）和（）表示，分別采用χ2及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料比較采用Student's t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織β-catenin和PD-L1 mRNA表達(dá)相關(guān)分析

為探討NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達(dá)情況，本研究用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測NSCLC組織和配對的癌旁組織β-catenin和PD-L1 mRNA表達(dá)，如圖1A和圖1B顯示，和配對的癌旁組織比較，絕大多數(shù)（27/30）NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達(dá)均明顯升高。Pearson相關(guān)分析顯示，NSCLC組織中β-catenin mRNA表達(dá)升高倍數(shù)和PD-L1 mRNA表達(dá)升高倍數(shù)呈明顯正相關(guān)。見圖1。

圖1 NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達(dá)

2.2 NSCLC組織β-catenin和PD-L1蛋白表達(dá)水平分析

為進(jìn)一步探討NSCLC組織中β-catenin和PD-L1蛋白表達(dá)情況及相互關(guān)系，采用免疫組化方法分別檢測連續(xù)的癌組織切片中β-catenin和PD-L1的蛋白表達(dá)，在β-catenin表達(dá)弱的非小細(xì)胞癌組織中PD-L1表達(dá)也弱，β-catenin表達(dá)強(qiáng)的癌組織中PD-L1表達(dá)也相應(yīng)較強(qiáng)。見圖2。

圖2 NSCLC組織中β-catenin和PD-L1蛋白表達(dá)

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）公布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)肺癌病例大約為220.7萬例，發(fā)病率居惡性腫瘤第2位[14-15]，而在中國，肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[16]，其中NSCLC是臨床中最為常見的肺癌類型之一。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個(gè)復(fù)雜的且由多種因素共同參與的過程[17]，其中較為經(jīng)典的有Wnt/β-catenin信號通路的異常激活和肺癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1參與免疫逃逸。

Wnt信號通路是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的一類信號通路，Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、極性、黏附等，參與很多發(fā)育過程，如胚胎發(fā)育，組織完整性，體軸模式，機(jī)體干細(xì)胞維持等。在正常成熟的細(xì)胞中，Wnt信號通路處于閉合狀態(tài)。Wnt信號通路分為經(jīng)典的β-catenin依賴性途徑和非經(jīng)典的β-catenin非依賴性途徑[18]。本研究提及的Wnt/β-catenin信號通路即為經(jīng)典Wnt信號通路[19]。β-catenin是Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)Wnt信號通路異常激活時(shí)，其由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Wnt/β-catenin信號通路已被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，可廣泛參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤耐藥[8-10]，在參與肺癌發(fā)生發(fā)展的諸多信號通路中，Wnt/β-catenin信號通路對肺癌的調(diào)控較為直接且復(fù)雜，是肺癌發(fā)生發(fā)展過程中較為重要的因素之一，其在NSCLC中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，在NSCLC的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵性作用[19-20]。

PD-1是一種細(xì)胞表面受體，在活化的T細(xì)胞上高表達(dá)，被認(rèn)為是T細(xì)胞衰竭的標(biāo)志，它可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性，激活腫瘤特異性T細(xì)胞的凋亡，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡，從而抑制免疫反應(yīng)并促進(jìn)自我耐受[21]。PD-L1是一型跨膜蛋白，可在某些腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞表達(dá)，是一種免疫反應(yīng)的共抑制因子[22]，其功能與免疫系統(tǒng)的抑制有關(guān)。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，其碳端免疫受體酪氨酸基開關(guān)基序發(fā)生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶Src同源蛋白2，使下游的脾酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇3激酶發(fā)生去磷酸化，從而傳遞抑制性信號，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用[2，23-25]。PD-1/PD-L1在腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞的抗原性降低，機(jī)體的免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別能力降低，導(dǎo)致抗腫瘤水平下降，促使了腫瘤的發(fā)展。馬薇等[26]發(fā)現(xiàn)PD-L1在47例NSCLC患者的癌細(xì)胞及癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)陽性率水平與肺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后生存呈負(fù)相關(guān)，提示PD-1/PD-L1信號通路可能參與了NSCLC的發(fā)展進(jìn)程。

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組織化學(xué)方法分別探討NSCLC組織及其癌旁組織中β-catenin和PD-L1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中β-catenin和PD-L1的表達(dá)均較其癌旁組織明顯升高，且二者的mRNA表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)，這個(gè)結(jié)果也在蛋白水平中得到了驗(yàn)證。根據(jù)獲得的研究結(jié)果本研究推測，在NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路激活后可能有相關(guān)基因參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)，而高表達(dá)的PD-L1與腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，降低了腫瘤局部微環(huán)境中T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，從而介導(dǎo)NSCLC免疫逃逸的發(fā)生，促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號通路的激活可能會誘導(dǎo)NSCLC中PD-L1的表達(dá)，而PD-L1又參與了NSCLC的免疫逃逸過程。因此，本研究猜測抑制Wnt/β-catenin信號通路可能會導(dǎo)致PD-L1表達(dá)量的減少，并且可能會降低NSCLC免疫逃避的發(fā)生，這為NSCLC的免疫療法提供了新的思路。然而，本研究僅顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)，因?qū)嶒?yàn)方法的局限性，仍存在許多的不足，還需進(jìn)行更為深入、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來探究Wnt/β-catenin信號通路可能存在的促進(jìn)PD-L1表達(dá)的分子機(jī)制，為Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)提供更為可靠的證據(jù)。雖然免疫療法在一些腫瘤的治療中取得了初步的進(jìn)展，但是未來臨床醫(yī)生和科研工作者將面臨更多的問題和挑戰(zhàn)，需要進(jìn)行更為深入、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕A(chǔ)研究并將其進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，最大限度地為每一位腫瘤患者提供提高生存率和生存質(zhì)量的診療服務(wù)。