段秀梅　張亞錳　王鵬飛　畢小鳳　海麗娜　秦文杰

【摘 要】 目的：建立復(fù)方苦參注射液中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量的測(cè)定方法。方法： 采用高效液相色譜法，色譜柱為Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.05%甲酸水溶液梯度洗脫，流速為0.8 mL·min^-1，檢測(cè)波長為284 nm，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果： 5-HMF質(zhì)量濃度在0.022～1.11 μg（r=0.9998）范圍內(nèi)質(zhì)量呈良好線性關(guān)系。5-HMF平均回收率為95.6%（RSD=6.70%）（n=9）。結(jié)論：本研究方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于復(fù)方苦參注射液中5-HMF的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方苦參注射液;5-羥甲基糠醛（5-HMF）;高效液相色譜（HPLC）;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）05-0065-03

基金項(xiàng)目：國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目資助（ZYBZH-C-JIN-43）;國家重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1701900）。

作者簡介：段秀梅（1978-），女，漢族，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)及中藥注射液再評(píng)價(jià)研究。E-mail：duanxiumei@zdjt.com

通信作者：海麗娜（1977-），女，回族，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)及中藥注射液再評(píng)價(jià)研究。E-mail：hailinai@zdjt.com;

秦文杰（1971-），女，漢族，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)及已上市藥品深度研究。E-mail：qinwenjie@zdjt.com

Determination of 5-Hydroxymethylfurfural in Compound Kushen Injection（CKI） by HPLC

DUAN Xiumei ZHANG Yameng WANG Pengfei BI Xiaofeng HAI Lina* QIN Wenjie*

Beijing Zhendong Guangming Pharmaceutical Research Institute，Beijing 100085，China

Abstract：Objective To establish a method for the determining the content of 5-hydroxymethylfurfural in Compound Kushen Injection（CKI）. Methods High performance liquid chromatography was utilized with Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） chromatographic column， and mobile phase of acetonitrile-0.05% formic acid aqueous solution was used for gradient elution at the flow rate was 0.8 mL·min^-1. The detection wavelength was 284 nm; column temperature was 20 ℃; injection volume 20 μL. Results The calibration curve of 5-hydroxymethylfurfural showed good linearity within the range of 0.02～1.11 μg·mL^-1. The average recovery of 5-HMF（n=9） was 95.6% with RSD of 6.70%. Conclusion The proposed method was accurate and reproducible enough to be used for the content determination of 5-hydroxymethylfurfural in CKI.

Key words：Compound Kusen Injection; 5-hydroxymethylfurfural; High Performance Liquid Chromatography（HPLC）; Content Determination

復(fù)方苦參注射液是由苦參和白土苓經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)方法精制而成的中藥注射液，具有清熱利濕，涼血解毒，散結(jié)止痛的功效，用于癌腫疼痛、出血^[1]。近年來，中藥注射劑的用藥安全性引起了越來越多人的關(guān)注。5-羥甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖或果糖在高溫或弱酸等條件下發(fā)生脫水產(chǎn)生的醛類化合物^[2]，可能存在于含糖類中藥注射劑中。文獻(xiàn)報(bào)道，該化合物可能引起血栓性靜脈炎^[3]、對(duì)人體的橫紋肌和內(nèi)臟也有損害^[4]，并具有一定程度的基因毒性^[5]。在《中國藥典》2020年版中，多個(gè)含葡萄糖的注射液的品種均規(guī)定了5-HMF的限量檢查。前期研究^[6]表明本品中含有葡萄糖、果糖等糖類成分，在生產(chǎn)和貯藏制劑時(shí)可能產(chǎn)生5-HMF。參考相關(guān)文獻(xiàn)，本文建立了HPLC法測(cè)定復(fù)方苦參注射液注射液中5-HMF的含量，以控制其含量水平，降低復(fù)方苦參注射液的用藥風(fēng)險(xiǎn)。F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（型號(hào)e2695分離單元，2998 PDA檢測(cè)器，廠家：Waters科技有限公司）;電子天平（型號(hào)XSE205DU，廠家：Mettler Toledo）;數(shù)控超聲清洗器（型號(hào)KQ5200DE，廠家：昆山市超聲儀器有限公司）。

5-HMF對(duì)照品（批號(hào)為Q042-180112，純度：98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）;聚山梨酯80（批號(hào)：20190502-3，南京威爾藥業(yè)股份有限公司）;復(fù)方苦參注射液（批號(hào)： 20181034，20181134，20181139，20181203，20181204，201812 09，20181212，20181213，20181214，20181215，20 190404，20180405，20190406，20190407，20190408，20190409，20190410，20190412，20190413，20190 414，山西振東制藥股份有限公司生產(chǎn)）;甲醇（色譜純，默克兩合有限公司）;其它試劑均為分析純，水為MilliPore系統(tǒng)所制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用 Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;柱溫20 ℃;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.05%甲酸溶液（B）梯度洗脫，洗脫梯度見表1，流速0.8 mL·min^-1;檢測(cè)波長284 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取5-HMF對(duì)照品適量，加水制成每1毫升含40 μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5～20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每1毫升含約0.5 μg的5-HMF溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方苦參注射液適量，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取聚山梨酯80適量，照復(fù)方苦參注射液制備方法，制成每1 毫升含2.5 mg的聚山梨酯80溶液，即得。

2.3 專屬性 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別如圖1所示。圖譜顯示，5-HMF峰形對(duì)稱性良好（拖尾因子為1.00），理論塔板數(shù)大于5000，另在測(cè)定波長284 nm處，陰性對(duì)照溶液在5-HMF峰的相應(yīng)位置，未見色譜峰，表明陰性樣品無干擾，該方法可用于5-HMF的含量測(cè)定。

2.4 線性 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋制得濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg·mL^-1的系列對(duì)照品溶液，濾過，分別取續(xù)濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x（μg·mL^-1）對(duì)峰面積y進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程為y=83030.77x-238.45，相關(guān)系數(shù)r為1.000，結(jié)果表明，5-HMF在0.02～1 μg·mL^-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下5-HMF對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄5-HMF的峰面積。結(jié)果顯示，5-HMF對(duì)照品的峰面積RSD為1.61%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方苦參注射液（20181034批），按“2.2.2”項(xiàng)下平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄5-HMF峰面積，并以外標(biāo)法計(jì)算其含量及其RSD值，結(jié)果顯示，5-HMF的平均含量為0.26 μg·mL^-1，RSD為2.06%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方苦參注射液（20181034批），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下存放，分別于0、4、8、12、18、24h后取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄5-HMF的峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)5-HMF峰面積RSD為2.34%，表明供試品溶液中5-HMF在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知5-HMF含量的復(fù)方苦參注射液（20181034批）5 mL，至10 mL量瓶中，共9份，分別按復(fù)方苦參注射液中5-HMF含量的50%、100%和150%水平添加，每個(gè)水平平行3份，加水定容至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄5-HMF的峰面積，并計(jì)算其含量及回收率，結(jié)果見表2，測(cè)得9份樣品平均回收率為95.56%，RSD為6.70%，小于8.0%（根據(jù)藥典中規(guī)定，含量為1 μg·g^-1時(shí)，RSD可為8.0%^[7]）。表明本方法準(zhǔn)確度較高。

2.9 檢測(cè)限與定量限 精密量取5-HMF對(duì)照品溶液適量，用水逐級(jí)稀釋。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3確定檢測(cè)限，以信噪比（S/N）為10確定定量限，結(jié)果顯示，5-HMF的檢出限和定量限分別為0.07 ng·mL^-1和0.22 ng·mL^-1。

2.10 樣品測(cè)定 取復(fù)方苦參注射液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄5-HMF的峰面積，并計(jì)算其含量。結(jié)果見表3。

3 討論

根據(jù)中國藥典品種葡萄糖注射液和葡萄糖氯化鈉注射液中5-HMF限度檢查的方法，折算成葡萄糖注射液（500 mL∶25 g）中最大允許量為6.1 mg，葡萄糖氯化鈉注射液（500 mL：葡萄糖25 g與氯化鈉4.5 g）中最大允許量為23.9 mg^[8];本品用法與用量每次20 mL，按葡萄糖注射液折算，則本品1 mL含5-HMF不超過0.305 mg·mL^-1，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定20批5-HMF的含量，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此限度。F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502

5-HMF作為糖降解產(chǎn)物，對(duì)人體具有一定的潛在危害，為保證含糖類成分的注射劑臨床用藥安全，建議對(duì)其進(jìn)行控制^[9]。本文建立了HPLC法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中5-HMF含量的方法，供試品無需前處理，快速簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為復(fù)方苦參注射液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，也為中藥注射液的安全性評(píng)價(jià)提供了參考。

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（收稿日期：2021-07-21 編輯：陶希睿）F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502