彭星星，高海軍，尹成華

（1. 河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450004；2. 河南省糧食科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450004）

小麥作為人類的主食之一，小麥粉可用于制作饅頭、面條等食物，是我國千家萬戶最重要的口糧來源。近年來由于環(huán)境污染、氣候異常等原因造成的病蟲害多發(fā)現(xiàn)象，使得原本用于經(jīng)濟作物上的殺蟲劑等農(nóng)藥在糧食作物上的使用也開始泛濫起來[1-4]，從而出現(xiàn)糧食中農(nóng)藥殘留量檢測超標(biāo)的情況。糧食中的農(nóng)藥殘留問題越來越受到大家的關(guān)注，許多國家都制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。目前有研究以 QuEChERS方法凈化結(jié)合GC-MS/MS檢測的方法[7-10]對蔬菜、水果、中藥材、食用菌中農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了測定，建立了高通量同時檢測多種農(nóng)藥殘留量的方法。

小麥中所用農(nóng)藥種類繁多，包括常見的有機磷類如地蟲硫磷、毒死蜱等，氨基甲酸酯類如仲丁威、抗蚜威等，有機氯類如艾氏劑等，還有菊酯類農(nóng)藥如聯(lián)苯菊酯等。本實驗在GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中 208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[11]的方法基礎(chǔ)上，以QuEChERS方法為基礎(chǔ)提取小麥中的農(nóng)藥，且對其中凈化吸附劑的種類和含量進(jìn)行了優(yōu)化，并結(jié)合運用氣相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（GC-MS/MS）技術(shù)分析其中20種常見農(nóng)藥殘留量的方法，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、分析回收率及基質(zhì)效應(yīng)等方式建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確、高通量測定小麥中不同種類農(nóng)藥殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗方法中的小麥均來自河南省各地市的抽查樣品，密封冷藏待測。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：SCION TQ/456GC型，德國布魯克公司；電子分析天平：BS2000S型，感量為 0.01 g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；臺式高速離心機：TG16.5型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；雙功能水浴恒溫振蕩器：HZ-9212S型，上?？等A生化儀器制造有限公司；水浴氮吹儀：MTN-2800型，上海旌派儀器有限公司；中央純水裝置：Centra R120型，英國ELGA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

取小麥樣品 500 g，粉碎后使其全部可通過425 μm的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，放入袋中密封保存。

1.3.2 樣品前處理方法

參考GB 23200.113—2018中7.1.2前處理方法，具體操作步驟為：準(zhǔn)確稱取 5 g樣品置于50 mL的塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，然后加入 15 mL（體積比為 99∶1）乙腈醋酸溶液，渦旋混勻，加入1.5 g醋酸鈉使乙腈層與水層分離開來，上層為乙腈層，再加入6 g無水硫酸鎂劇烈振蕩 1 min使其除去乙腈層中的水分，4 200 r/min離心5 min，得上清液。依次稱取0.4 g無水硫酸鎂、0.1 g PSA、0.2 g C18和0.1 g GCB于15 mL離心管中，加入8 mL上清液，置于垂直渦旋振蕩器上渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于5 mL試管中，氮吹后加入20 μL內(nèi)標(biāo)和1 mL乙酸乙酯渦旋混勻，過0.22 μm有機濾膜。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

用乙酸乙酯將質(zhì)量濃度為 100.0 μg/mL環(huán)氧七氯B標(biāo)液稀釋為5.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

用乙酸乙酯將質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL的20種農(nóng)藥目標(biāo)物稀釋成5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后用乙酸乙酯進(jìn)行逐級稀釋制得質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、500 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液?？瞻谆|(zhì)溶液氮氣吹干，分別加入1.0 mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，配制成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 色譜儀條件

進(jìn)樣口溫度設(shè)為 250 ℃；色譜柱選擇 DB-5 MS毛細(xì)管型（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序如下所示：

1.3.5 質(zhì)譜儀條件

質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置Table 1 The parameter settings of mass spectrometer

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 WPS office（11.1.010463）軟件對實驗中數(shù)據(jù)進(jìn)行公式擬合和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的選擇

本實驗選用乙腈作為提取溶劑[12]。小麥中含有大量豐富的有機物質(zhì)，比如淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、膳食纖維等復(fù)雜的有機物，僅僅使用單一的吸附劑不能產(chǎn)生明顯的凈化效果。無水MgSO4的作用是能夠吸附乙腈層中剩余的水分，同時無水MgSO4也能夠降低乙腈層的極性[13]。溶液萃取常用的凈化劑包括PSA、C18和GCB。其中PSA的作用是吸附存在于小麥基質(zhì)溶液中的大多數(shù)有機物質(zhì)如碳水化合物、有機酸類、脂肪酸類和酚類，另外也可吸附溶液中少量的色素[14-16]；C18的作用是吸附存在于小麥基質(zhì)溶液中的脂肪以及酯類等非極性的干擾物質(zhì)[17]，這樣可以避免非極性物質(zhì)的干擾；GCB的作用是吸附存在于小麥基質(zhì)溶液中的色素[18]，使凈化液澄清透明無色。另外有研究表明，C18或GCB與PSA同時使用能夠明顯降低溶液的基質(zhì)效應(yīng)[19]。當(dāng)然，這幾種凈化劑除了能夠去除基質(zhì)中雜質(zhì)以外，也可能會對基質(zhì)中的某些目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附作用。以仲丁威、滅線磷、異草酮和草酮為例來考察不同凈化條件對其回收率的影響效果，結(jié)果如圖1～4所示。

在 80.0 μg/kg農(nóng)藥添加水平下考察無水MgSO4、PSA、C18和GCB添加量對仲丁威、滅線磷、異草酮和草酮回收率的影響。由圖 1可知，在 PSA添加量為 400 mg、C18添加量為400 mg、GCB添加量為200 mg時，當(dāng)無水MgSO4使用量為400 mg時，4種農(nóng)藥回收率達(dá)到最高值，隨著無水 MgSO4使用量的增多四種農(nóng)藥回收率反而有所降低，因此確定無水 MgSO4使用量為400 mg。由圖 2可知，在無水 MgSO4添加量為1 200 mg、C18添加量為400 mg、GCB添加量為200 mg時，當(dāng)PSA使用量為100 mg時，這4種農(nóng)藥的回收率均達(dá)到最大值，隨著PSA用量越來越大，4種農(nóng)藥回收率反而有所降低，因此確定PSA添加量為100 mg。由圖3可知，在無水MgSO4添加量為1 200 mg、PSA添加量為400 mg、GCB添加量為200 mg時，當(dāng)C18添加量為200 mg時四種農(nóng)藥的回收率達(dá)到最高值，當(dāng)C18用量變大時，4種農(nóng)藥回收率有所降低，因此確定C18添加量為200 mg。由圖4可知，在無水MgSO4添加量為1 200 mg、PSA添加量為400 mg、C18添加量為400 mg時，當(dāng)GCB用量變大時，提取液褪色更明顯，但四種農(nóng)藥的回收率明顯降低，因此確定GCB添加量為100 mg。

圖1 無水硫酸鎂對4種農(nóng)藥回收率的影響Fig.1 The effect of MgSO4 on the recovery of four pesticides

圖2 PSA對4種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 The effect of PSA on the recovery of four pesticides

圖3 C18對4種農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 The effect of C18 on the recovery of four pesticides

圖4 GCB對4種農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 The effect of GCB on the recovery of four pesticides

通過實驗優(yōu)化，最終選擇 400 mg無水MgSO4、100 mg PSA、200 mg C18與 100 mg GCB作為凈化吸附劑對提取溶液進(jìn)行凈化。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜參數(shù)采取正離子模式，對20種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯B在m/z 50～500的范圍內(nèi)采用Scan（全掃描模式）進(jìn)樣，得到TIC圖，再使用質(zhì)譜軟件標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行化合物檢索，采用 Product模式（子離子掃描方式）得到子離子碎片，然后在5～40 eV范圍內(nèi)通過改變特征離子電壓的方式對碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，以此來建立 MRM（多反應(yīng)監(jiān)測模式）方法。20種農(nóng)藥的MRM相關(guān)參數(shù)結(jié)果如表2所示，加入內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯B的小麥基質(zhì)空白譜圖如圖5所示，用小麥基質(zhì)溶液配制的20種混標(biāo)（100 ng/mL）和內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯B的MRM色譜圖如圖6所示。

圖5 加入內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯B小麥空白基質(zhì)總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of heptachlor epoxide B in wheat shoot matrix

圖6 20種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯B在小麥基質(zhì)中總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of 20 pesticides and heptachlor epoxide B in wheat shoot matrix

表2 20種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)的保留時間、定量離子對、定性離子對與碰撞能量結(jié)果Table 2 Retention time, qualitative ions,quantitative ions and collision energy of the 20 pesticides

續(xù)表2

從圖5～6可以看出，小麥空白樣品中的基質(zhì)干擾較大，有較多的雜峰。用小麥空白基質(zhì)配制的20種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液峰型較好，各農(nóng)藥化合物均完全分離。實驗采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行質(zhì)譜檢測，有效地避免了小麥基質(zhì)中出現(xiàn)假陽性的情況。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與基質(zhì)效應(yīng)

20種農(nóng)藥混標(biāo)用小麥空白基質(zhì)溶液配制成5～500 ng/mL的梯度標(biāo)液，按照優(yōu)化后的儀器條件上機。測定結(jié)果采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以各農(nóng)藥化合物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比（X）為橫坐標(biāo)，農(nóng)藥化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。參照朱?；ǖ萚20]的方法，取0.08 mg/kg加標(biāo)水平的樣品進(jìn)行分析，測定信噪比，分別以每種農(nóng)藥3倍、10倍信噪比（S/N）計算檢出限和定量限，結(jié)果見表3。

由表 3可知，20種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)均大于0.990，檢出限在 0.01～0.16 μg/kg范圍內(nèi)，定量限在 0.04～0.52 μg/kg 范圍內(nèi)。

表3 20種農(nóng)藥的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Calibration curve, R2, limits of detection, limits of quantitation, matrix effect, recoveries and relative standard deviations of 20 pesticides

在氣相色譜-質(zhì)譜分析中往往會存在基質(zhì)效應(yīng)[21]。分別采用小麥基質(zhì)溶液和乙酸乙酯溶劑配制系列標(biāo)液，建立兩組校準(zhǔn)曲線，計算基質(zhì)效應(yīng)強度 ME。ME（%）=[（基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率）- 1]×100，ME＜-50%或者M(jìn)E＞+ 50%為強基質(zhì)效應(yīng)，-20%＜ME＜+20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，-50%≤ME≤-20%或者+20%≤ME≤+50%為中等基質(zhì)效應(yīng)[22-23]。結(jié)果表明：除克百威、野麥畏、艾氏劑、草酮及聯(lián)苯菊酯 5種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)較弱外，異丙威、敵敵畏、滅線磷、異草酮、地蟲硫磷、抗蚜威、嗪草酮、甲霜靈、甲基嘧啶磷、氟酰胺及甲氰菊酯11種農(nóng)藥出現(xiàn)中等強度的基質(zhì)效應(yīng)，仲丁威、二甲戊靈、多效唑及環(huán)丙唑醇4種農(nóng)藥出現(xiàn)強基質(zhì)效應(yīng)。綜上可知，為了防止本實驗中20種目標(biāo)物農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，同時也為了提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實驗采取小麥基質(zhì)溶液配制20種目標(biāo)化合物的校準(zhǔn)曲線。

2.4 重復(fù)性和準(zhǔn)確性

取同樣空白的小麥樣品5.00 g，20種農(nóng)藥添加水平分別為80.0、200.0和400.0 μg/kg下做加標(biāo)實驗，平行進(jìn)樣6次，計算平均回收率，再通過標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均回收率的比值來計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如表3所示，在添加水平為80 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在75.24%～98.29%范圍內(nèi)，RSD為0.57%～3.13%；添加水平為200 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在 82.01%～105.71%范圍內(nèi)，RSD為0.67%～3.98%；添加水平為400 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在 94.91%～106.14%范圍內(nèi)，RSD為1.26%～3.08%。由此可見方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性良好，能夠滿足實驗中20種農(nóng)藥殘留量的分析測試要求。

2.5 實際樣品分析

以本實驗方法對抽查的 370份小麥安全監(jiān)測樣品進(jìn)行測定，其中兩份樣品檢出克百威，殘留量分別為0.040和0.033 mg/kg，一份樣品檢出滅線磷，殘留量為0.042 mg/kg。根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[24]判定，克百威和滅線磷的殘留量均未超標(biāo)。

3 結(jié)論

本實驗建立了 QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS），采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，內(nèi)標(biāo)法定量檢測小麥中20種農(nóng)藥殘留量的方法。與GB 23200.113—2018中7.1.2前處理方法相比，本方法通過對凈化吸附劑的優(yōu)化，節(jié)約了無水MgSO4、PSA、C18的用量，將無水MgSO4添加量從1 200 mg減少到了400 mg，將PSA的添加量從400 mg減少到了100 mg，將C18的添加量從400 mg減少到了200 mg；另外本方法加入了100 mg GCB，可以有效去除小麥提取液中的色素。

20種農(nóng)藥在 GC-MS/MS上的響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)超過 0.99，檢出限范圍是 0.01～0.16 μg/kg，定量限范圍是 0.04～0.52 μg/kg。除克百威、野麥畏、艾氏劑、草酮及聯(lián)苯菊酯5種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)較弱外，異丙威、敵敵畏、滅線磷、異草酮、地蟲硫磷、抗蚜威、嗪草酮、甲霜靈、甲基嘧啶磷、氟酰胺及甲氰菊酯11種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為中等強度，仲丁威、二甲戊靈、多效唑及環(huán)丙唑醇4種農(nóng)藥出現(xiàn)強基質(zhì)效應(yīng)。因此，為了提高20種農(nóng)藥測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實驗采取基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

在添加水平為80 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在 75.24%～98.29%范圍內(nèi)，RSD 為 0.57%～3.13%；添加水平為200 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在82.01%～105.71%范圍內(nèi)，RSD為0.67%～3.98%；添加水平為400 μg/kg時，20種農(nóng)藥平均回收率在94.91%～106.14%范圍內(nèi)，RSD為1.26%～3.08%。該方法適合批量前處理，準(zhǔn)確度、重復(fù)性和靈敏度均能夠達(dá)到農(nóng)藥多殘留檢測的技術(shù)要求，可以用于小麥中20種農(nóng)藥殘留量的檢測。