趙 萌，吳文珊，陳友鈴，陳楊菲

(福建師范大學生命科學學院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室，福州 350108)

薜荔FicuspumilaL. var.pumila屬蕁麻目Urticales?？芃oraceae榕屬Ficus常綠攀援藤本植物，廣泛分布于我國長江以南各個省區(qū)，是熱帶和亞熱帶植物生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵樹種(張秀實和吳征鎰, 1998)。薜荔食用部分富含果膠、蛋白質(zhì)、維生素及礦質(zhì)元素等養(yǎng)分(吳文珊和方玉霖, 1999)，是開發(fā)低脂低熱保健飲品的首選資源且具有廣闊的開發(fā)利用前景(陸春等, 2007; 秦愛文等, 2016)，但薜荔結(jié)實依賴膜翅目Hymenoptera榕小蜂科Agaonidae的薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae(Hill) Wiebes，沒有榕小蜂造訪的薜荔花序必將凋落，而薜荔榕小蜂也依賴薜荔雄花序的癭花做為繁育后代的場所，一方消亡將導致另一方的絕滅，二者之間為互惠共生關(guān)系(馬煒梁等, 1997)。薜荔雌、雄株一年產(chǎn)生1～3次花序，不同植株、植株所處生境和地理位置以及年氣候條件均影響植株產(chǎn)生花序的批次(何坤耀, 1991; 陳勇等, 2002)，只有當雌、雄花序的雌花期與雄花序的小蜂出飛期一致時，雌株才能結(jié)實，小蜂才能完成繁殖(Harrison, 2003; Cook and Rasplus, 2003; 張媛等, 2016)，但野生狀態(tài)下，時常出現(xiàn)小蜂出飛期滯后于花序雌花期的現(xiàn)象，從而導致大量落果。本研究利用人工氣候箱對蛹期薜荔榕小蜂進行培養(yǎng)，探究溫度對小蜂發(fā)育和出飛率的影響，以期縮短小蜂的發(fā)育時長，為蜂源缺失的榕樹花序提供人工培養(yǎng)的雌蜂，維持榕-蜂共生體系的穩(wěn)定，并為植食性寄生蜂的培養(yǎng)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 野生薜荔榕小蜂及蟲癭發(fā)育觀測

薜荔榕小蜂為薜荔的傳粉小蜂，樣品采集于福州閩侯鎮(zhèn)(119°12′E, 26°01′N)。

2019年8月初，對新生長的薜荔雄花序進行標記，并選取其中的90個用100目的尼龍網(wǎng)袋(20 cm×20 cm)罩住以阻止小蜂進入薜荔果實干擾實驗，每天觀察花序發(fā)育狀態(tài)，8月31日隱頭花序的苞口開始松動，果內(nèi)散發(fā)出芳香氣味，表明花序小花開放進入雌花期，于是打開網(wǎng)袋，每果放入15頭小蜂產(chǎn)卵，以小蜂進入榕果產(chǎn)卵的時間為準，翌日統(tǒng)計每果進蜂數(shù)，共獲得產(chǎn)卵薜荔雄果88個。此后，每7 d隨機采摘3個已被產(chǎn)卵的雄果，用密封袋裝好帶回實驗室，將其縱向剖開，隨機取30個蟲癭在立體顯微鏡下解剖，用解剖針將蟲癭劃開并取出小蜂，置于載玻片上，使用顯微鏡觀察并記錄小蜂發(fā)育過程中的形態(tài)變化及蟲癭表皮層、保護層、內(nèi)皮層的形態(tài)變化，監(jiān)測榕小蜂發(fā)育期，并對以下數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計：

(1)小蜂發(fā)育成熟度：將榕小蜂發(fā)育分為 6個階段：預蛹、初期蛹、中期蛹、成熟蛹、羽化成蟲(蟲癭內(nèi))，出飛成蟲。為了能夠更加直觀地在圖表中反映出其發(fā)育程度，分別用1～6依次為各發(fā)育階段賦值，則發(fā)育成熟度為實驗小蜂的各發(fā)育階段的平均值(每隔7 d測定一次)；

(2)蟲癭殼含水率的測定：每隔14 d測定一次，將剔除榕小蜂后的蟲癭殼(最后一次測定是收集榕小蜂羽化離開蟲癭后第1天上午10時的蟲癭殼)立即置于2 mL指形管內(nèi)，防止水分流失，每管10個蟲癭，共三組，使用分析天平稱量，記錄烘干前蟲癭殼重量，隨后置于80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后，記錄蟲癭烘干后重量。蟲癭含水率(%)=(烘干前蟲癭殼重量-烘干后蟲癭殼重量)/烘干前蟲癭殼重量×100；

(3)羽化期榕小蜂陸續(xù)離開蟲癭，出飛5 d后，統(tǒng)計：

雌(雄)蜂出飛率(%)=雌(雄)蜂出飛數(shù)/雌(雄)蜂總數(shù)×100

雌(雄)蜂未出飛率(%)=雌(雄)蜂未出飛數(shù)/雌(雄)蜂總數(shù)×100

總出飛率(%)=(雌蜂出飛數(shù)+雄蜂出飛數(shù))/ 蟲癭總數(shù)×100

(4)雌蜂壽命：在榕小蜂出飛的第1天上午，用120目的絹紗網(wǎng)袋分別收集野生未攜粉出飛的雌蜂(去除果內(nèi)雄蕊)與攜粉出飛的雌蜂。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中放置1張無菌濾紙，在濾紙上分散滴加2%無菌水配制的蜂蜜液100 μL，用毛筆將小蜂放入培養(yǎng)皿中，并用封口膜密封，根據(jù)薜荔榕小蜂最佳貯藏條件(戴志聰?shù)? 2010)，將其置于10℃恒溫箱中。分別在8 ∶ 00、16 ∶ 00和24 ∶ 00對小蜂進行觀察，記錄死亡數(shù)量與活性。每個培養(yǎng)皿60有小蜂，重復6次。

雌蜂的平均壽命=∑Li/N,Li為第i頭雌蜂壽命，N為雌蜂總數(shù)。

利用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，利用單因素方差分析(one-way ANOVA)實驗數(shù)據(jù)的差異顯著性，以P值檢驗。

1.2 蛹期薜荔榕小蜂的人工氣候箱培養(yǎng)

2019年11月11日，鏡檢表明薜荔榕小蜂已發(fā)育至預蛹期，采集攜蜂榕果50個帶回實驗室，用5% NaClO溶液對薜荔榕果進行30 min浸泡后，用75%酒精擦拭，并立即用刀片縱切將其均分為4瓣，隨機抽取一部分蟲癭鏡檢，進一步確認果內(nèi)薜荔榕小蜂的發(fā)育狀態(tài)(剔除小蜂發(fā)育非預蛹期的薜荔果)。分別選取15個果(60瓣)將其編號后，平鋪在26℃、28℃、30℃(已通過薜荔榕小蜂的瓊脂培養(yǎng)的預實驗，對22～32℃范圍的溫度進行篩選)人工氣候箱內(nèi)(無光照，依據(jù)自然狀態(tài)下的幼期榕小蜂生存于高濕度的榕果中，相對濕度設(shè)定為90%±5%)。每3 d對蟲癭進行一次鏡檢，每次分別從各溫度處理的果中隨機取30粒蟲癭，觀察小蜂的發(fā)育狀況以及蟲癭的形態(tài)特征。待第1頭雄蜂從其中一瓣果出飛后，立即將它與其余3瓣重新合并(28℃保留5個果、共20瓣不合并)，單果放入120目的絹紗網(wǎng)袋(防止小蜂逃逸)，待無小蜂出飛時，將榕果內(nèi)蟲癭分為內(nèi)、外兩層，外層厚度為3 mm，分別統(tǒng)計榕果內(nèi)、外層的蟲癭數(shù)量與已出飛小蜂數(shù)量，并計算內(nèi)、外層的小蜂出飛率：內(nèi)(外)層出飛率(%)=內(nèi)(外)層小蜂出飛數(shù) / 內(nèi)(外)層蟲癭數(shù)×100；統(tǒng)計雌、雄蜂的出飛數(shù)量和蟲癭總數(shù)，并借助體視顯微鏡觀察記錄未出飛的小蜂的發(fā)育狀況。計算1.1中的各項，但每3 d測定一次小蜂發(fā)育成熟度，每6 d測定一次蟲癭含水率，其余采樣周期不變。

1.3 雌蜂自主出飛率研究

野生自然條件下，在小蜂即將出飛時，采集3個雄花序帶回實驗室備用。切開榕果用鑷子將內(nèi)含雌蜂的蟲癭(雌蜂黑色，雄蜂棕色，成蟲顏色能透出蟲癭，供判斷)取下30粒，分別裝入0.5 mL PCR管內(nèi)(每管1粒，并將蘸有蒸餾水的無菌濾紙條一并放入，起保濕作用)，設(shè)5個重復。其余榕果切成相等的9塊(蟲癭集生于果瓣上)，分別將含雄成蟲的蟲癭去除，裝入放有濕潤無菌棉條的廣口瓶中，室溫下觀察，2周后待小蜂全部死亡，統(tǒng)計已出飛雌蜂數(shù)量、咬破蟲癭但未出飛的雌蜂(圖1)數(shù)量，以及未咬破蟲癭的雌蜂數(shù)量，計算雌蜂出飛率，并與1.1中野生雌蜂(整果)出飛率進行比較。

圖1 咬破蟲癭但未能出飛的雌蜂Fig.1 Female wasp bit through the gall but failed to fly out

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對小蜂發(fā)育及出飛的影響

28℃培養(yǎng)條件下，薜荔榕小蜂從預蛹至出飛的發(fā)育時長為27 d，較26℃提早3 d出飛，比同期野生小蜂提早53 d(圖2)；28℃培養(yǎng)條件下，雄蜂的出飛率與26℃無顯著差異(P>0.05)，但28℃的雌蜂出飛率極顯著高于26℃(P<0.01)(表1)。雄蜂出飛時若將切分開的榕果果瓣合并，可提高24.27%的雌蜂出飛率，雄蜂出飛率無顯著差異(P>0.05)。比較28℃條件下果瓣內(nèi)外層的小蜂總出飛率，內(nèi)層80.56%，而外層僅38.91%，差異極顯著(P<0.01)，這可能由于外層蟲癭易脫水，導致蟲癭殼硬化，給小蜂的破殼造成的困難。

30℃條件下，榕小蜂在預蛹、初期蛹和中期蛹發(fā)育階段的死亡率分別為16.67%、33.33%和51.67%，盡管有近一半的小蜂(48.33%)能發(fā)育至成熟蛹階段，但在4 d內(nèi)全部死亡，未能羽化。推測30℃可能是薜荔榕小蜂的高溫耐受性極限，小蜂對高溫的耐受性存在個體差異。

表1 不同溫度條件下羽化期榕小蜂的出飛率及蟲癭內(nèi)未出飛小蜂的發(fā)育狀態(tài)(%)Table 1 Eclosion rate of wasps in emergence period and developmental condition of wasps in galls at different temperatures

圖2 溫度對蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育的影響Fig.2 Effect of temperatures on the development of W. pumilae at the pupal stage

2.2 人工氣候箱培養(yǎng)下的蟲癭殼含水率及結(jié)構(gòu)變化

對蟲癭殼含水率進行測定，結(jié)果表明，28℃時蟲癭含水率下降最快(圖3)，但28℃培養(yǎng)下小蜂的出飛時間比26℃提早3 d，導致28℃小蜂出飛時的蟲癭含水率(16.78%)極顯著高于26℃(13.16%)，推測26℃條件下雌蜂的出飛率極顯著低于28℃的原因，是小蜂所在蟲癭殼的低含水率增加了其破殼出飛的難度。

圖3 不同溫度條件下的蟲癭含水率Fig.3 Water content of galls at different temperatures

蟲癭殼分為：表皮層、保護層和內(nèi)皮層(圖4-A)，蟲癭腔被小蜂占據(jù)。野生初蛹期的蟲癭表皮層呈淺黃色，濕潤且柔軟；保護層呈米白色且富有彈性，為蟲癭腔內(nèi)的蛹提供良好的生存發(fā)育空間；內(nèi)皮層呈褐色，質(zhì)感濕潤柔軟；羽化成蟲階段表皮層變?yōu)闇\褐色，略有脫水，依然較為濕潤，保護層無明顯變化，內(nèi)皮層無顏色變化，但因失水質(zhì)感較脆(圖4-B)；人工氣候箱培養(yǎng)條件下，初蛹期的蟲癭表皮層呈黃色，但明顯較薄(與野生型比較)，而保護層和內(nèi)皮層無明顯變化(圖4-C)；羽化成蟲階段表皮層極度干燥，緊貼在保護層上，而保護層幾乎失去彈性，硬度極大；內(nèi)皮層干硬，易碎成粉末狀(圖4-D)。

圖4 野生和人工氣候箱培養(yǎng)條件下初蛹期及羽化成蟲階段的蟲癭殼結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparison of structure of gall shell at the primary pupal and emerged adult stages in the wild and in the artificial culture within climate incubator注：A-B，野生初蛹期和羽化成蟲階段蟲癭殼結(jié)構(gòu)；C-D，人工氣候箱培養(yǎng)初蛹期和羽化成蟲階段蟲癭殼結(jié)構(gòu)；Ep，表皮層；Pl，保護層；En，內(nèi)皮層；比例尺= 0.25 mm。Note: A-B, Structure of the gall shell at primary pupal and emerged adult stages in the wild; C-D, Structure of the gall shell at primary pupal and emerged adult stages in the climate incubator; Ep, Epdidermis; Pl, Protective layer; En, Endodermis; Scale bar=0.25 mm.

2.3 雌蜂自主出飛的可能性

無雄蜂條件下，單粒與集生蟲癭的雌蜂出飛率均極顯著低于野生組(表2)，表明雌蜂具備自主出飛的能力，但破殼效率低，同時也表明雄蜂在雌蜂所在的蟲癭上開掘的交配孔有助于雌蜂擴孔出飛，可大幅提高雌蜂出飛率。

單粒蟲癭的雌蜂出飛率低于集生蟲癭的原因在于：單粒蟲癭中存在雌蜂已咬破蟲癭但未能出飛的現(xiàn)象(9.33%)，這可能是因為蟲癭未被固定，雌蜂破殼更耗體力；或可能是單粒蟲癭更易于脫水，蟲癭壁較硬，小蜂活性更弱的緣故。這也正是人工氣候箱培養(yǎng)時，在羽化期將開瓣的薜荔再合并成整果可提高雌蜂交配率、出飛率的原因。

2.4 雌蜂壽命比較

對野生攜粉、不攜粉出飛和人工培養(yǎng)出飛的雌蜂壽命進行比較(圖5)，結(jié)果表明：小蜂平均壽命依次為10.8、9.0、8.7 d，野生攜粉出飛的小蜂壽命極顯著長于野生不攜粉出飛和人工培養(yǎng)的小蜂(P<0.01)，后二者之間的平均壽命無顯著差異(P>0.05)，表明花粉可能對延長小蜂壽命有重要作用。

野生攜粉出飛、不攜粉出飛以及人工培養(yǎng)的雌蜂在前4 d未出現(xiàn)死亡(圖5)，且活力較強，因而在小蜂野外放飛應用過程中，小蜂儲存和運輸?shù)臅r間若能控制在4 d以內(nèi)則效果最佳。

表2 雌蜂自主出飛率與未出飛雌蜂所在的蟲癭狀態(tài)(%)Table 2 Independent eclosion rate of female wasps and gall state with female wasps not flying out

圖5 野生與人工培養(yǎng)薜荔傳粉雌蜂的存活曲線Fig.5 Survival curve of female wasps of Wiebesia pumilae in the wild and in artificial culture

3 結(jié)論與討論

薜荔榕小蜂生活在榕樹雌花子房形成的蟲癭內(nèi)，羽化小蜂必須咬破蟲癭殼才能離開寄主(Anstett, 2001; Yang, 2002)，因此小蜂能否順利出飛是人工培養(yǎng)成敗的標志，而影響出飛的原因主要有：(1)培養(yǎng)過程中蟲癭殼含水率的下降，導致蟲癭殼硬化，造成榕小蜂開鑿蟲癭壁的難度增大，阻礙雌、雄蜂出飛，同時，也導致蟲癭內(nèi)環(huán)境濕度降低，影響小蜂的活力與壽命(Patinoetal., 1996; Dunnetal., 2008)。盡管設(shè)置了高濕度(RH90%)培養(yǎng)條件，但28℃、27 d的長培養(yǎng)周期仍舊導致蟲癭殼的嚴重脫水，因此，如何提高蟲癭含水率是亟待克服的技術(shù)瓶頸。(2)雌蜂出飛依賴于雄蜂，即雄蜂先于雌蜂鉆出蟲癭，通過嗅覺感知雌蜂產(chǎn)生的氣味信息尋找蟲癭內(nèi)未出飛的雌蜂(Ortiz-Barrientosetal., 2004; Krishnanetal., 2014; Liuetal., 2019)，雄蜂開鑿交配孔并與雌蜂交配(Howard and Blomquist, 2005；Nagamotoetal., 2005)，而后雌蜂擴大交配孔后出飛。本試驗結(jié)果表明，在沒有交配孔的情況下，雌蜂的自主出飛率低于15%，在28℃雄蜂出飛期果瓣不合并條件下的雌蜂出飛率為27.63%，果瓣合并可使雌蜂出飛率達到51.90%，推測果瓣開放導致部分已出蟲癭的雄蜂掉落在瓣外，為雌蜂開鑿交配孔的雄蜂數(shù)量減少；同時開放系統(tǒng)削弱了雌蜂產(chǎn)生的氣味，降低了雄蜂對雌蜂精確定位的效率，從而導致雌蜂出飛率下降。(3)盡管28℃培養(yǎng)縮短了蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育時長，但并不是薜荔榕小蜂成蟲生存的最適溫度，由于一定溫度范圍內(nèi)，榕小蜂壽命隨溫度降低而延長(戴志聰?shù)? 2010)。因此，建議將榕小蜂發(fā)育至成熟期的榕果轉(zhuǎn)至相對較低的溫度環(huán)境中(例如，22℃或25℃)，既延長榕小蜂壽命，提高榕小蜂活力(提高打洞能力)，也有利于蟲癭提高含水量(易被榕小蜂打穿)，從而提高榕小蜂的出飛率。