王 爽，劉星堯，賈昊天，劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省實(shí)驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，哈爾濱 150030)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種以腎功能迅速下降的臨床綜合征，同時AKI是住院患者最常見的并發(fā)癥之一，使患者死亡風(fēng)險增加10～15倍[1]。研究表明，AKI的發(fā)病機(jī)制主要與腎臟組織炎癥反應(yīng)、壞死和氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)[2-3]。順鉑是臨床上一種常見的抗腫瘤化學(xué)藥物，其代謝毒副作用能夠損傷腎小管細(xì)胞并誘導(dǎo)腎臟組織炎癥，最終導(dǎo)致AKI發(fā)生[4-5]。在獸醫(yī)臨床上，犬AKI發(fā)病急、發(fā)病快，且病犬更易在藥物代謝毒副作用下發(fā)展成為腎衰竭，嚴(yán)重時可導(dǎo)致病犬死亡。因此，探究預(yù)防和治療犬AKI的有效方法對獸醫(yī)臨床具有重要意義。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無色、劇毒、酸性氣味的有害氣體，能夠引起機(jī)體多種器官發(fā)生損傷[6-7]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)存在H2S氣體分子[8]，它成為動物體內(nèi)繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種氣體信號分子，在不同組織中發(fā)揮著重要的生理功能。內(nèi)源性H2S具有很強(qiáng)的抗氧化作用，它能清除活性氧(ROS)，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的水平[9]。另外，H2S具有明顯的抗炎作用，能夠下調(diào)炎癥因子，如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，給予結(jié)腸炎小鼠H2S可降低炎癥因子TNF-α的表達(dá)，而抑制小鼠體內(nèi)H2S的合成易誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎。硫氫化鈉(NaHS)是外源性H2S供體，外源給予NaHS能夠明顯改善大鼠氣道炎癥[11]。此外，近幾年有報道稱阿托伐他汀可通過提高內(nèi)源性H2S緩解小鼠腎臟組織炎癥、細(xì)胞凋亡和過度的氧化應(yīng)激，進(jìn)而緩解AKI[12]。但H2S能否在犬AKI的防治中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用還未可知。鑒于此，本試驗通過靜脈注射順鉑建立犬AKI模型，探究H2S對順鉑誘導(dǎo)的犬腎臟組織功能、抗氧化水平和炎癥因子等變化的影響，以期為緩解AKI提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

18只2～3歲、體重為8～12 kg的健康成年雄性比格犬飼養(yǎng)于清潔干燥、通風(fēng)良好、室溫(20±2)℃的動物房中，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑及儀器

注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司；NaHS由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床外科教研室提供；肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、GSH、過氧化氫(H2O2)和NO試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green熒光染料均購自寶日醫(yī)生物有限公司；HE染液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、環(huán)氧合酶2(COX2)、誘導(dǎo)型一氧化物合酶(iNOS)、IL-4和IL-10抗體均購自萬類生物科技有限公司；GAPDH和辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Epoch酶標(biāo)儀(LD-96A)購自BioTek公司；體視顯微鏡(TE2000-U)購自Nikon公司；化學(xué)發(fā)光呈像儀(Tanon 5200)購自上海天能公司；熒光定量PCR儀(羅氏480)購自Roche公司。

1.3 試驗動物分組與處理

18只健康成年比格犬隨機(jī)分為對照組(C)、順鉑組(cis)和硫化氫+順鉑組(H+cis)3組，每組6只。對照組犬經(jīng)頭靜脈注射生理鹽水；順鉑組犬經(jīng)頭靜脈注射5 mg/kg順鉑[13]；硫化氫+順鉑組(H+cis)犬在注射順鉑前30 min，經(jīng)頭靜脈注射1 mg/kg NaHS溶液，并且每隔24 h注射1次，共3次。

1.4 樣品采集與處理

注射順鉑72 h后對犬進(jìn)行麻醉，靜脈采血，4 ℃放置2 h，3 500 r/min離心10 min后收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。收集血液樣本后以外科方式無菌采集左側(cè)部分腎臟組織，用生理鹽水漂洗后，一部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛，用于制備腎臟組織病理切片，剩余組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 生化指標(biāo)檢測 使用生化試劑盒檢測血清中Scr和BUN含量，評價犬腎臟組織損傷程度。通過生化試劑盒檢測犬腎臟中GSH、H2O2和NO的含量，評價順鉑致犬腎臟氧化損傷的程度以及H2S對犬腎臟抗氧化能力的影響。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 腎臟病理學(xué)檢測 將腎臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h后，無水乙醇脫水，石蠟包埋并進(jìn)行切片，脫蠟，HE常規(guī)染色，于顯微鏡下觀察腎臟組織的病理變化。

1.5.3 RNA的提取及實(shí)時熒光定量PCR 采用Trizol法提取各組腎臟總RNA。 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。 根據(jù)GenBank中犬IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、NF-κB、COX2、iNOS基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物信息見表1。引物均由廣州擎科生物有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20 μL：RNA 2 μg，2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5.4 總蛋白提取和Western blotting 稱取1 g犬腎臟提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度一致，取400 μL蛋白樣品加入100 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水煮15 min，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂乳封閉1 h，一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、TNF-α(1∶500)、NF-κB(1∶500)、COX2(1∶1 000)、iNOS (1∶500)、IL-4 (1∶500)、IL-10 (1∶500)及GAPDH (1∶50 000)于4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗(1∶10 000)1 h，ECL顯影檢測蛋白表達(dá)。使用Image J 1.48軟件分析蛋白條帶灰度值。

表1 引物信息

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用t檢驗。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 H2S對犬血清BUN和Scr的影響

由圖1可知，與C組相比，cis組犬血清中BUN和Scr含量均極顯著增加(P<0.01)，H+cis組Scr含量極顯著增加(P<0.01)；與cis組相比，H+cis組犬血清中BUN和Scr含量均極顯著降低(P<0.01)。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組犬血清中BUN和Scr含量Fig.1 Contents of BUN and scr in serum of dogs in each group

2.2 H2S對順鉑處理犬腎臟組織病理變化的影響

由圖2可知，C組腎臟組織腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，球囊腔明顯(a)，血管壁清晰，未觀察到明顯病變。而cis組犬腎臟組織出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(b)，腎小管上皮細(xì)胞變性，管腔內(nèi)有蛋白性物質(zhì)(c)，間質(zhì)血管明顯充血(d)。H+cis組犬腎臟組織可見腎小球囊腔狹窄(e)，腎小管上皮細(xì)胞變性(f)。

圖2 各組犬腎臟組織病理學(xué)觀察(200×)Fig.2 Histopathological observation of dog kidney tissues in each group (200×)

2.3 H2S對犬腎臟中GSH、H2O2和NO含量的影響

由圖3可知，與C組相比，cis組犬腎臟中GSH含量極顯著降低(P<0.01)，而H2O2和NO含量均極顯著增加(P<0.01)；H+cis組犬腎臟中GSH、H2O2和NO含量均無顯著差異(P>0.05)。與cis組相比，H+cis組犬腎臟中GSH水平極顯著增加(P<0.01)，H2O2和NO含量極顯著下降(P<0.01)。

圖3 各組犬腎臟組織GSH、H2O2和NO含量Fig.3 Contents of GSH,H2O2 and NO in kidney tissues of dogs in each group

2.4 H2S對犬腎臟組織中炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

由圖4可知，與C組相比，cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS的mRNA相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，IL-4和IL-10的mRNA相對表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)；H+cis組IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB和COX2的mRNA相對表達(dá)量均顯著或極顯著增加(P<0.05；P<0.01)，IL-10的相對表達(dá)量極顯著下降(P<0.01),IL-4和iNOS的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。與cis組相比，H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS的mRNA相對表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01),IL-4和IL-10的mRNA相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)。IL-10的mRNA相對表達(dá)量極顯著下降而IL-4的mRNA相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 H2S對犬腎臟組織中中炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

由圖5可知，與C組相比，cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS蛋白相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01);IL-4和IL-10蛋白的相對表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)；H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB和iNOS蛋白相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，COX2蛋白相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05),IL-4和IL-10的蛋白相對表達(dá)量顯著或極顯著降低(P<0.05；P<0.01);與cis組相比，H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS蛋白相對表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01),IL-4和IL-10蛋白相對表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)。

圖4 各組犬腎臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of mRNA of inflammatory factors in dog kidney tissues in each group

圖5 各組犬腎臟組織中炎癥因子蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of protein of inflammatory factors in dog kidney tissues in each group

3 討 論

H2S最初被認(rèn)為是一種無色、劇毒、具有特殊臭雞蛋味的氣體，低劑量就能對機(jī)體造成損傷。直到1996年，Abe等[8]研究發(fā)現(xiàn)，H2S作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)介質(zhì)而發(fā)揮重要作用，自此關(guān)于動物體內(nèi)氣體分子H2S的研究成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。已有研究證實(shí)，H2S參與哺乳動物多種組織的各種病理生理過程并發(fā)揮重要作用。外源給予H2S能夠通過減輕氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙來防止心肌結(jié)構(gòu)破壞，緩解心肌缺血再灌注損傷[14]。崔永華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S可以通過激活海馬組織硫氧還原蛋白系統(tǒng)來降低氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的早期腦損傷。此外，H2S能下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子來減輕細(xì)胞炎性損傷，發(fā)揮抗炎作用[16]。 Sidhapuriwala等[17]研究發(fā)現(xiàn)，給予10 mg/kg NaHS可下調(diào)小鼠胰腺和肺臟的炎癥反應(yīng)，并減少促炎趨化因子和黏附因子的表達(dá)。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，H2S可以降低細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及IL-1β的表達(dá)來緩解臭氧誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥。然而在獸醫(yī)領(lǐng)域中，關(guān)于H2S對犬腎臟組織的保護(hù)作用鮮有報道。基于此，本研究首次從順鉑造成犬腎臟氧化損傷的角度出發(fā)，利用H2S抗氧化、抗炎的特性，探究H2S對順鉑引起的犬AKI是否具有保護(hù)作用。

AKI是臨床上常見的疾病，一般治療包括透析和腎臟移植。由于治療成本高導(dǎo)致很難應(yīng)用到獸醫(yī)臨床上，因此探究有效預(yù)防AKI手段對獸醫(yī)臨床十分重要。血液Scr和BUN是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，當(dāng)血液Scr和BUN水平短時間內(nèi)升高，提示AKI的發(fā)生[19]。本試驗結(jié)果顯示，靜脈注射順鉑72 h后犬血液中Scr和BUN極顯著升高，說明犬AKI模型構(gòu)建成功。而H2S能下調(diào)犬血液中Scr和BUN水平，同時結(jié)合組織病理切片結(jié)果，提示H2S能有效緩解順鉑誘導(dǎo)的犬AKI。此外，生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，cis組犬腎臟組織中GSH含量極顯著降低，而H2O2和NO含量極顯著上升。GSH是動物體內(nèi)一種重要的還原劑，能夠清除動物體內(nèi)自由基，參與機(jī)體多種氧化還原反應(yīng)。ROS和活性氮(RNS)是動物體內(nèi)主要氧化物，包括H2O2、羥自由基(·OH)、NO和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等。正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于一個動態(tài)平衡，當(dāng)氧化物在機(jī)體內(nèi)累積過多會引起機(jī)體氧化應(yīng)激[20- 21]。本試驗結(jié)果顯示，順鉑誘導(dǎo)犬腎臟組織發(fā)生氧化應(yīng)激，而H2S能夠下調(diào)H2O2和NO水平，提高GSH含量進(jìn)而提高犬腎臟組織抗氧化能力。此外，氧化應(yīng)激能夠激活免疫活性蛋白如細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等[22]。NF-κB是動物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，它不僅可以調(diào)控免疫細(xì)胞的激活，還廣泛參與機(jī)體的應(yīng)激和炎癥等反應(yīng)。許多外部刺激如H2O2、TNF-α等均能激活NF-κB通路，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎因子IL-1β和IL-6的生成和釋放。IL-1β是動物體內(nèi)炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞因子，主要體現(xiàn)在它能誘導(dǎo)其他炎性因子如IL-6、趨化因子和黏附分子等的合成。AKI常表現(xiàn)為腎臟組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，Prasada等[23]觀察到AKI患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6顯著上升。TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種促炎因子，它可以誘導(dǎo)白介素和干擾素等多肽物質(zhì)引起炎癥反應(yīng)[24]。Zhu等[25]報道在小鼠AKI模型中，腎臟中NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著上升。與Zhu等[25]報道相似，本試驗結(jié)果顯示，順鉑處理后犬腎臟中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB相對表達(dá)量明顯升高，提示腎臟組織發(fā)生炎癥。COX2是合成前列腺素的關(guān)鍵酶，正常生理情況下在動物體內(nèi)幾乎檢測不到，當(dāng)機(jī)體受到炎性因子刺激可激活COX2，而抗炎因子如IL-4和IL-10則可抑制機(jī)體COX2水平[26]。與COX2相似，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)iNOS水平相對較低，但在炎癥等病理情況下其表達(dá)會顯著升高[27]，并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，NO又會與超氧陰離子結(jié)合生成過氧亞硝基陰離子而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]，進(jìn)而損傷組織細(xì)胞。本試驗結(jié)果顯示，cis組犬腎臟組織中COX2和iNOS相對表達(dá)量較對照組明顯升高，進(jìn)一步表明順鉑誘導(dǎo)犬腎臟組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。IL-4和IL-10是動物體內(nèi)重要的抗炎因子，能限制促炎因子的表達(dá)[29-30]。H2S可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生抗炎作用。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，給予外源性H2S能夠降低大鼠肺臟組織中IL-6水平，同時提高抗炎因子IL-10表達(dá)進(jìn)而減輕肺損傷。楊永華等[32]研究發(fā)現(xiàn)，用H2S處理大鼠肢體缺血再灌注損傷模型后，大鼠血清中促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α水平明顯下降，提示H2S減輕大鼠局部炎性反應(yīng)。本試驗結(jié)果顯示，H2S預(yù)處理可以下調(diào)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS水平，提高IL-4和IL-10相對表達(dá)量，說明H2S能夠緩解順鉑誘導(dǎo)的犬腎臟組織炎性損傷。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，順鉑通過誘導(dǎo)犬腎臟組織氧化應(yīng)激，促進(jìn)腎臟中NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6、COX2和iNOS的表達(dá)，并下調(diào)IL-4和IL-10水平，導(dǎo)致犬AKI的發(fā)生，而H2S預(yù)處理可通過提高腎臟組織抗氧化抗炎能力緩解順鉑引起的犬AKI。