高 黎，郭 姍，李藝博， 盧麗雯，張彥喜

特納牙是指由局部感染和創(chuàng)傷引起的牙齒釉質(zhì)發(fā)育不全，好發(fā)于前磨牙。近年來，個別前牙尤其上頜切牙顏色或形態(tài)改變在臨床上比較常見，主要表現(xiàn)為前牙釉質(zhì)表面呈黃色至棕黃色改變，多位于上前牙唇面切1/3至中1/3，黃染區(qū)域與正常釉質(zhì)交界清晰，形狀不規(guī)則，嚴重者釉質(zhì)表面或可出現(xiàn)明顯缺損。這種前牙釉質(zhì)顏色和形態(tài)改變，影響患者美觀及心理。其表現(xiàn)為典型的特納牙，但在臨床上常被誤認為氟斑牙。該研究通過對SD大鼠下頜前牙區(qū)牙槽突垂直黏膜施加外力，建立外傷性特納牙大鼠模型，觀察外傷性釉質(zhì)發(fā)育不全的臨床表現(xiàn)，并進行微觀結(jié)構(gòu)觀察和能譜分析(energy dispersive spectrometry，EDS)，研究前牙區(qū)外傷是否出現(xiàn)特納牙性釉質(zhì)發(fā)育不全，為后期研究大鼠特納牙和氟斑牙的相關(guān)區(qū)別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設(shè)備一次性口腔器械盒，眼科剪，鑷子，持針器，手術(shù)刀及手術(shù)刀柄，木棒(一端接觸面積2.5 mm×2.0 mm)，0.9%氯化鈉溶液，蒸餾水；0～20牛(N)彈簧秤(昆山托普泰克公司)；游標卡尺(上海美耐特公司)；Nikon相機(日本尼康公司)；掃描電子顯微鏡(scanning electronic microscopes，SEM)、EDS能譜分析儀(德國ZEISS公司)。

1.2 實驗動物與分組鄭州大學(xué)動物實驗室提供的40只1 d齡SD大鼠作為受試對象，隨機分為四組(性別、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義)，即對照組和3個實驗組，每組10只；實驗組依據(jù)施力分為5N力組、10N力組、15N力組。

1.3 實驗方法對照組不做任何處理；實驗組在大鼠下前牙區(qū)垂直于黏膜加力(圖1)，施力工具是木棒柱形壓力裝置，木棒一端與牙槽突接觸，接觸面積2.5 mm×2.0 mm；另一端與彈簧秤相連，分別施加5、10、15 N力(圖2)，在彈簧秤刻度的5、10、15、20 N處設(shè)置明顯標記。在瞬間施力時，在彈簧秤示數(shù)達到所需要的最大力值時即停止施力。相同條件下飼養(yǎng)，觀察下頜切牙的生長狀況。SD大鼠在出生后30 d，下頜第一磨牙牙根發(fā)育基本完成，咬合關(guān)系穩(wěn)定，此時引頸處死大鼠。剝離下頜骨下切牙段，0.9%氯化鈉溶液、蒸餾水反復(fù)沖洗干凈。

圖1 受力示意圖

圖2 施力圖A:5N力組；B:10N力組；C:15N力組

1.4 記錄標準牙體唇面釉質(zhì)出現(xiàn)變色，表面光滑、完整，記錄為釉質(zhì)變色；牙體唇面釉質(zhì)出現(xiàn)粗糙、凹坑狀、缺損，即記錄為釉質(zhì)缺損；釉質(zhì)缺損和釉質(zhì)變色同時出現(xiàn)，則記為釉質(zhì)缺損。

1.5 SEM觀察及鈣磷分析選取實驗組釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)域與對照組相對應(yīng)的釉質(zhì)正常區(qū)域，制成實驗所需的釉質(zhì)塊，放入無水乙醇中超聲震蕩清洗5 min，然后將樣本干燥處理，用導(dǎo)電膠固定在載物臺上，放入真空鍍膜機中，用SEM對牙釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)進行觀察，并檢測牙釉質(zhì)表面鈣(Ca)磷(P)元素含量的質(zhì)量分數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗對四組SD大鼠下頜切牙的正常牙數(shù)和釉質(zhì)不全數(shù)及對10N力組和15N力組未萌牙數(shù)進行差異性比較，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05；組間兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗水準為α=0.008。對實驗組發(fā)育不全的牙釉質(zhì)與對照組正常牙釉質(zhì)Ca、P含量采用兩獨立樣本t檢驗進行比較。

2 結(jié)果

2.1 不同組外傷后一般情況在實驗過程中，實驗動物創(chuàng)面愈合良好，未發(fā)生感染和死亡。對照組SD大鼠下頜切牙區(qū)黏膜紅潤；5N力組SD大鼠受力部位黏膜有輕微的紅色壓痕；10N力組受力部位黏膜大部分有深的壓痕，有黏膜下血斑形成，有5例穿破黏膜，出血，但未刺破骨皮質(zhì)；15N力組受力部位黏膜穿破10例，出血，但均未穿破其下頜骨皮質(zhì)。

2.2 30 d齡SD大鼠下頜切牙各個標準大體表現(xiàn)釉質(zhì)正常：牙齒表面光滑無缺損，顏色均勻，呈淡黃色,透明度好(圖3)。釉質(zhì)著色：主要表現(xiàn)為白斑，表面光滑，完整，透明度降低(圖4)。釉質(zhì)缺損：釉質(zhì)表面粗糙出現(xiàn)凹坑狀缺損(圖5)。牙齒未萌：牙齒未完全萌出(圖6)。

圖3 釉質(zhì)正常牙齒A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙冠狀面觀

圖4 牙齒釉質(zhì)白色斑塊A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙矢狀面觀 C：下頜切牙冠狀面觀

圖5 牙齒釉質(zhì)缺損A：下頜切牙大體觀 B：下頜切牙矢狀面觀 C：下頜切牙冠狀面觀

圖6 下頜切牙單個牙萌出A、B：下頜切牙大體觀

2.3 四組30 d齡SD大鼠下頜切牙發(fā)育情況對照組、5N力組、10N力組、15N力組四組SD大鼠釉質(zhì)正常牙數(shù)和釉質(zhì)發(fā)育不全牙數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=50.402，P< 0.05)；四組之間兩兩比較，除外對照組與5N力組(χ2=2.105，P= 0.147)、10N力組與15N力組(χ2=1.111，P=0.496)，其余各組間比較P值均<0.008。10N力組(1/19)和15N力組(7/13)間未萌牙數(shù)/已萌牙數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.625，P=0.018)。見表1。

表1 四組30 d齡SD大鼠下頜切牙發(fā)育情況(n)

2.4 SEM觀察結(jié)果使用SEM觀察，結(jié)果顯示：對照組正常釉質(zhì)表面平整光滑；實驗組釉質(zhì)變色區(qū)表面不平整，部分呈凹坑狀；釉質(zhì)缺損區(qū)表面粗糙，部分區(qū)域呈剝脫狀。見圖7。

圖7 SEM下的不同釉質(zhì)區(qū)域

2.5 EDS測量實驗組及對照組樣本Ca、P含量及鈣磷比(Ca/P)與對照組釉質(zhì)正常區(qū)相比，實驗組釉質(zhì)異常區(qū)鈣含量較低(P<0.05)，磷含量亦較低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。鈣磷比(P=0.79)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 外傷牙釉質(zhì)異常區(qū)與對照組釉質(zhì)正常區(qū)Ca和P的質(zhì)量分數(shù)

3 討論

氟斑牙依據(jù)其臨床表現(xiàn)分為四種不同類型：釉質(zhì)變色(Ⅰ型)，釉質(zhì)異常聚結(jié)(Ⅱ型)，部分釉質(zhì)缺損型(Ⅲ型)，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ組合型(Ⅳ型)[1]。釉質(zhì)外觀上氟斑牙與特納牙的表現(xiàn)相似，臨床上診斷易混淆，常需結(jié)合病史才能加以鑒別，從多方面進行區(qū)別研究十分重要。關(guān)于外傷性特納牙，有學(xué)者通過實驗動物建模的方法探討牙胚外傷造成釉質(zhì)發(fā)育不全的機理，猴和犬因牙齒生理解剖結(jié)構(gòu)與人類相似可作為外傷性特納牙建模的理想動物模型。Thylstrup et al[2]曾用猴來建立乳牙外傷模型研究對繼承恒牙胚的影響，取得較好效果。本研究組前期也通過挫入犬乳牙研究對繼承恒牙胚的影響，結(jié)果顯示繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全發(fā)生率達到85.4 %，主要表現(xiàn)為釉質(zhì)著色和缺損[3]。文獻中未見報道大鼠牙外傷模型；若同時研究氟斑牙與特納牙的相關(guān)區(qū)別，大鼠是更為理想的建模動物。嚙齒類動物的切牙唇側(cè)釉質(zhì)與人牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)類似[4]，其牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)從內(nèi)到外大致可分為四層：內(nèi)層無釉柱結(jié)構(gòu)層、釉柱交錯結(jié)構(gòu)層、釉柱平行排列結(jié)構(gòu)層、表面無釉柱結(jié)構(gòu)層[5-6]。另外，SD大鼠牙胚發(fā)育每個階段界限明確：出生1 d牙胚處于鐘狀末期，此時牙源性細胞特異性分化和礦化組織開始形成[7]。出生2 d牙胚進入分泌早期，牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)大量形成[8]。如果牙胚在分泌期及之前受到外傷，之后的釉質(zhì)發(fā)育就可能會受到影響[9]。因此，本實驗選用1 d齡SD大鼠建立外傷性特納牙模型。

趙繼剛 等[10]通過以25 mm2的接觸面對犬暴露恒牙牙胚施加3 kg的壓力時，出現(xiàn)牙齒顏色的改變。因為1 d齡的SD大鼠下頜牙槽嵴尚未形成，骨壁較薄，直接在牙槽骨上施力即可傳導(dǎo)至牙胚上，影響牙胚發(fā)育[11]。因此，本實驗選擇在下前牙區(qū)沿牙槽突長軸垂直黏膜施力來進行預(yù)實驗。在實驗前對SD大鼠進行施力大小測試，施加5 N的力時，小鼠下頜骨受力部位黏膜出現(xiàn)輕微紅色壓痕；在施加15 N的力時，壓力頭可以穿透下頜黏膜但未穿破牙槽骨；當(dāng)施加20 N時，壓力頭可輕松穿破黏膜及牙槽骨，術(shù)后SD大鼠表現(xiàn)痛苦且影響進食，這會對實驗建模準確性造成影響故此力值予以舍棄。因此，本研究選取力值大小為0、5、10、15 N。由于牙胚外傷是由口腔頜面部創(chuàng)傷引起，一般受的力是瞬時力，因此，本實驗也選擇瞬時力。在彈簧秤刻度的5、10、15 N處設(shè)置明顯標記,在快速施力時，在彈簧秤示數(shù)達到所需要的最大力值時即停止施力。本實驗中，5 N力組僅有2例出現(xiàn)釉質(zhì)變色，發(fā)生率較低(10 %)，且未見釉質(zhì)缺損，不適合建立牙胚外傷模型。通過比較10 N力組與15 N力組中均出現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育不全(釉質(zhì)變色和缺損)，兩組均可以建立外傷性特納牙模型，但15 N力組牙齒未萌數(shù)明顯高于10 N力組。因此，10 N力更適合建立SD大鼠外傷性特納牙模型。

本實驗在掃描電鏡下觀察到實驗組釉質(zhì)變色區(qū)域表面粗糙不平，釉質(zhì)缺損區(qū)釉質(zhì)孔隙增多，表層釉質(zhì)結(jié)構(gòu)缺失，裸露內(nèi)層釉質(zhì)。這一結(jié)果說明了牙胚外傷可明顯導(dǎo)致釉質(zhì)表層結(jié)構(gòu)的改變。而未萌牙的出現(xiàn)則是牙胚外傷所造成更嚴重的后果，可能是外力使牙胚破損[12],牙胚死亡停止發(fā)育或牙胚發(fā)生移位導(dǎo)致了牙齒萌出障礙。本實驗中釉質(zhì)變色主要表現(xiàn)為鼠牙齒表面的白堊色斑塊，可能是外傷擾亂了釉質(zhì)形成的正常程序，導(dǎo)致不正?；|(zhì)蛋白復(fù)合物的形成，過多的釉原蛋白潴留在牙釉質(zhì)中，改變了釉質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變釉質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)[13-14]。釉質(zhì)主要成分是無機物質(zhì)-羥基磷灰石。鈣磷含量一定程度上反應(yīng)了釉質(zhì)的礦化程度及再礦化能力[15]。本研究通過能譜分析顯示釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)鈣磷含量均較正常區(qū)域低，推測可能是釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)域的釉質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，部分缺損導(dǎo)致無機物質(zhì)減少。牙釉質(zhì)異常區(qū)與正常區(qū)相比，鈣磷比無統(tǒng)計學(xué)差異，進一步說明了外傷性特納牙不同于遺傳性釉質(zhì)發(fā)育不全，其對釉質(zhì)形成的主要影響在于釉質(zhì)的量而不是釉質(zhì)的礦化成分。

本實驗表明5 mm2受力面施加力10 N適合建立大鼠外傷性特納牙模型。通過微觀結(jié)構(gòu)分析，外傷性特納牙釉質(zhì)的量減少，表面粗糙，凹凸不平，鈣磷含量減少。